人表皮黑素细胞体外培养的条件探讨及鉴定

人表皮黑素细胞体外培养的条件探讨及鉴定
汪丽俐;朱晓浚
【摘要】目的:体外培养人包皮组织来源的黑素细胞并对其进行生物学鉴定.方法:包皮取自小儿,采用分离酶和胰蛋白酶两步消化法获得表皮细胞悬液,采用商品化培养基M254及其配套的黑素细胞生长添加因子(HMGS)培养出纯化的黑素细胞,用多巴染色及抗S-100免疫细胞化学染色的方法对培养出的黑素细胞进行鉴定.结果:培养出的黑素细胞体积大,胞浆丰富,有2-5个树突,呈克隆样生长,Dopa染色及S-100抗体染色阳性.结论:该种方法培养出的黑素细胞纯度高,增殖快,能有效避免成纤维细胞的污染.
【期刊名称】《皮肤性病诊疗学杂志》
【年(卷),期】2011(018)002
【总页数】4页(P87-90)
【关键词】黑素细胞;细胞培养技术;鉴定
【作者】汪丽俐;朱晓浚
【作者单位】广州医学院附属广佛医院,广东,佛山,528251;中山大学附属第二医院,广东,广州,510120
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2
黑素细胞起源于神经嵴,在成人表皮中,黑素细胞与基底层角质形成细胞按1∶10的
比例存在于基底层中[1]。

随着对色素性疾病研究的不断深入,黑素细胞的体外培养为研究色素性疾病的发病机制和治疗提供了重要的方法和途径。

1982年 Eisinger 等[2]首先报道在培养基中添加佛波醋酸酯 (TPA)、霍乱毒素 (CT)等,成功地在体外获得了黑素细胞纯化培养,其后关于各种体外黑素细胞培养方法的报道层出不穷。

正常情况下,黑素细胞生长缓慢,增值能力极为有限,且极易被角质形成细胞及成纤维细胞污染。

我们利用 Cascade公司的商品化培养基M 254及其配套的黑素细胞添加因子 (HMGS),采用分离酶和胰蛋白酶两步消化法及胰酶差别消化法成功培养出大量可以稳定传代的黑素细胞,并对其进行了生物学鉴定及特征观察。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 包皮从中山大学附属第二医院小儿外科包皮套扎术中获取。

1.1.2 试剂和仪器 M 254培养基及黑素细胞生长添加因子 (HMGS)购自 Cascade 公司,胰蛋白酶、MTT、DMSO、青链双抗、TritonX-100、10%胎牛血清均购自Gibco公司,两性霉素 B购于上海新先锋有限公司,分离酶、左旋多巴 (L-DOPA)购自美国 sigma公司。

鼠抗 S-100蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠 IgG抗体-HRP多聚体及 DAB显色盒购自北京中杉金桥公司。

倒置显微镜 (Leica MPS-30,德国 )、CO2培养箱 (Heraeus BB16,德国 )、超净工作台 (苏净 BHC-1300ⅡA/B3,苏州安泰空气技术有限公司)、Wellscan MK3全自动多功能酶标仪 (Labsystems Dragon,芬兰)。

1.2 方法
1.2.1 人正常黑素细胞的分离和培养取小儿外科 5岁以内男性儿童包皮套扎术后包皮,立即放入含 100 U/mL青-链双抗和5μg/mL两性霉素B的 D-HANKS液中浸泡 15分钟。

取出包皮放于直径为 60 mm的培养皿中,用含 100 U/mL青-链双抗的 D-HANKS液反复冲洗三遍,每次冲洗完后放入新的培养皿中。

无菌条件下用眼
科剪剪去皮下组织及部分真皮,然后再用 D-HANKS液冲洗一遍,放入新的培养皿中,用剪刀细心修剪成2 mm×10 mm的小条,0.2%分离酶4℃消化过夜[3]。

第二天
用眼科镊轻轻分离真表皮,注意避免被成纤维细胞污染,且分离真表皮的镊子不能混用。

轻轻撕下表皮,放入新的培养皿中,加入0.25%的胰酶-EDTA继续消化 10分钟,血清终止消化。

用吸管吹打成细胞悬液,1 000转/分离心5分钟,倾倒上清,加入 D-HANKS液重悬,再次离心,充分洗脱残留的 EDTA。

倾倒上清,用添加了HMGS、100 U/mL青-链双抗的 M 254培养基重悬。

200目筛网过滤并进行细胞计数,按
5×105/mL密度接种于 25 mL培养瓶,37℃、5%CO2培养箱中培养[4]。

24 h后
换液去除漂浮的死细胞。

继续培养,2～3天换液一次。

原代细胞长满 80%时用
0.25%的胰酶-EDTA消化传代,在第二代接种时采用胰酶差别消化法去除角质形成
细胞。

实验选用第 2、3代细胞。

1.2.2 黑素细胞形态观察及传代与纯培养原代培养的细胞 24 h开始贴壁,可见到瓶底贴附大量的角质形成细胞,角质形成细胞间散在数个多级树突细胞,这些细胞大部
分胞体圆而小,有两个对称的树突,少数细胞胞体大,有 2～5个树突。

培养 1～7 d
细胞生长缓慢,每两天换液一次,除去漂浮的死细胞,见到角质形成细胞间的树突细胞呈集落生长,当所有细胞长到 80%融合时,进行传代。

用差别胰酶消化法除去角质形成细胞,将先消化出来的树突细胞按2×105/mL接种,一般传代两次即可得到较纯的黑素细胞。

1.2.3 黑素细胞生长率的测定采用 96孔板MTT[4]法:取第 3代处于对数生长期的黑素细胞,0.25%的胰酶-EDTA消化,细胞计数,调整浓度为2×104/mL,每孔200μL 接种于 96孔板,于37℃、5%CO2培养箱中培养,每 24小时随机取 6个孔做MTT 比色实验,共 12天,以时间为横轴,每日的平均OD值(490)为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.2.4 黑素细胞的鉴定
1.2.4.1 L-DOPA[5]染色将培养好的第 2代黑素细胞接种于放有盖玻片的 6孔板
中,待细胞爬满盖玻片 80%时,取出盖玻片,用冰 D-HANKS液洗两次,5%的甲醛固定 30分钟,再用冰D-HANKS液洗两次,加入 0.1%的 L-DOPA,放入37℃温箱中温浴4 h,弃去多巴液,用 D-HANKS液冲洗一次,10%的甲醛固定 30分钟,冰 D-HANKS液洗两次,Giemsa复染 10分钟,去离子水冲洗至干净。

1.2.4.2 抗 S-100免疫细胞化学染色将细胞爬片置于载玻片上,用 95%的乙醇固定10分钟,自然干燥,D-HANKS液冲洗一次,滴加 TritonX-100室温下 10分钟,滴加一滴 3%H2 O2室温下 10分钟,以阻断内源性过氧化物酶活性,D-HANKS液冲洗三次,滴加一滴一抗鼠抗 S-100蛋白单克隆抗体,4℃过夜。

滴加二抗山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体,加 DAB显色 5秒,冲洗,复染,脱色,透明,封片即完成。

2 结果
2.1 正常包皮组织及分离酶消化过的包皮组织病理
可以见到正常的包皮组织经 Dispase酶消化后,真表皮于基底膜带完全分离,基底层位于表皮侧 (图 1,2)。

2.2 培养出的第二代人表皮黑素细胞
相差显微镜下可见到黑素细胞折光性较强,包体较小,有 2～5个树突,呈集落样生长(图 3)。

2.3 MTT法绘制的第二代人表皮黑素细胞的生长曲线
图 1 正常包皮皮肤病理 (HE染色,100×)
图 3 相差显微镜下第二代黑素细胞(200×)
图 5 多巴染色的黑素细胞(400×)
黑素细胞在第三天进入对数生长期,一周后生长渐缓慢,处于平台期 (图 4)。

2.4 多巴染色及抗 S-100免疫细胞化学染色
多巴染色可见到黑素细胞胞体及树突全部被染成黑色呈阳性;抗 S-100染色见到黑素细胞胞体及树突被染成淡黄色呈阳性,两种染色方法均证实培养出的细胞为黑素
细胞(图 5,6)。

图 2 0.2%Dispase酶消化过夜的的包皮皮肤真表皮明显分离,基底细胞位于表皮侧(HE染色,100×)
图 4 人正常表皮μC生成曲线
图 6 抗 S-100染色后的人黑素细胞(200×)
3 讨论
在反复的黑素细胞培养过程中,我们总结了以下经验:首先是培养基和平衡盐溶液的选择。

我们选择的是商品化的培养基M 254及其配套的黑素细胞添加因子(HMGS),HMGS包含了黑素细胞生长所需的刺激因子牛垂体浸出物、胎牛血清、牛胰岛素、转移因子、碱性成纤维细胞生长因子、氢化可的松、肝素、佛波醇乙酸酯等。

若采用自行配制培养基,因添加因子种类繁多,不仅各种因子浓度不好把握,而且容易导致污染。

使用该套培养基方便快捷,但其价格较昂贵。

本研究选择不含Ca2+的 D-HANKs平衡盐溶液而不是 PBS溶液,因为 Ca2+会影响黑素细胞的贴附及胰酶的消化活力。

为了抑制细菌及真菌的生长,每次采集的包皮标本均用加入了 100 U/mL青-链双抗和5μg/mL两性霉素 B的 D-HANKs液浸泡 15分钟,并在培养基中加入 100 U/mL青-链双抗,但培养基中不能加用两性霉素 B,因培养发现其可明显抑制黑素细胞的生长。

其次是标本的选择和处理。

我们选择小儿外科套扎的包皮作为标本,一般均为学龄前儿童,相较成年人其黑素细胞增值活力强、传代次数多,且污染相对较少。

标本的真表皮分离,我们采用浓度为 0.2%分离酶,4℃消化过夜,真表皮轻松剥离,避免了真皮中成纤维细胞污染的可能 (注意剥离过程中真表皮的镊子不能混用)。

分离得到的表皮再用 0.25%的胰酶-EDTA消化 10分钟,终止消化,吹打,过滤,离心。

既往报道的真表皮分离多采用单用胰酶消化法,我们比较了胰酶和分离酶消化过夜的差别,发现胰酶消化能力较弱,其主要功能是水解细胞间的蛋白质,完全分离真表皮较难,且分
离后的基底层细胞大部分附着在真皮侧,而黑素细胞在基底层,所以既容易污染成纤维细胞又不易获得大量的黑素细胞。

分离酶则从基底膜层分离真表皮,分离完整且基底层细胞全部附着在表皮一侧。

再次即接种密度的选择。

原代接种时密度应偏大,因为大部分是漂浮的死细胞,24小时换液即可除掉。

初次接种的密度我们一般选择浓度为5×105/mL,一般 5天可连成片,达到 80%融合,若浓度太小,细胞间没有接触,很难融合成片。

最后是角质形成细胞与黑素细胞的分离。

角质形成细胞对黑素细胞的分裂增殖是有促进作用的,我们观察到,第一代含角质形成细胞的接种液接种于培养瓶后,里面的黑素细胞生长速度较快,活力较强,但因实验需要我们需要得到纯的黑素细胞,因此在首次传代的时候,我们采用差别胰酶法,角质形成细胞贴附能力较强,一般常温0.25%的胰酶 10分钟才能从培养皿底部脱离,而黑素细胞 3～5分钟即可,利用这一点我们可以得到相当纯的黑素细胞用于实验。

[参考文献 ]
【相关文献】
[1] William WD,Berger TG,Elston DM.安德鲁斯临床皮肤病学 [M].徐世正,译.北京:科学出版社,2008:3.
[2] Eisinger M,Marco O.Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in thepresenceof phorbol easter and cholera toxin[J].Proc Natl Acad SciUSA,1982,79:2018.
[3] 王鹰,邓军,杨希川,等.正常人黑素细胞体外培养及生物学鉴定[J].第三军医大学学
报,2006,28(21):2141-2142.
[4] 司徒镇强,吴军正.细胞培养 [M].西安:世界图书出版西安公司,2004:200-201.
[5] 项蕾红,郑志忠,祝绿川,等.黑素细胞体外纯培养及生物学鉴定[J].临床皮肤科杂
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