反相高效液相色谱法测定龙眼中阿维菌素残留量

反相高效液相色谱法测定龙眼中阿维菌素残留量
查玉兵;杨春亮;刘丽丽;王晓芳;林玲;程盛华
【摘要】建立了利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定龙眼中阿维菌素残留量的方法.以乙腈为提取溶剂,用碱性氧化铝固相萃取小柱进行净化,经N-甲基咪唑和三氟乙酸酐衍生化后,用高效液相色谱法-荧光检测器(激发波长为365nm,发射波长为470nm)进行测定.在0.05 mg/L～4.0 mg/L浓度范围内,阿维菌素标准工作溶液的色谱峰高与质量浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.9997,方法的添加回收率为88.0%～94.0%,相对标准偏差RSD在1.81%～3.55%之间,检出限为0.001mg/kg.实验证明,该方法简便、快速、准确,可用于龙眼中阿维菌素残留量的测定.
【期刊名称】《分析仪器》
【年(卷),期】2008(000)005
【总页数】3页(P36-38)
【关键词】高效液相色谱法;阿维菌素;龙眼;残留
【作者】查玉兵;杨春亮;刘丽丽;王晓芳;林玲;程盛华
【作者单位】中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001
【正文语种】中文
【中图分类】TH74
1 前言
阿维菌素是由放线菌经发酵产生的代谢产物，为大环内酯类抗生素杀虫剂、杀螨剂[1，2]，广泛用于葱、西兰花、甘蓝等出口蔬菜的生产。

该药因杀虫范围广、持效期长，加之其制剂的有效成分含量较低，毒性会随之下降，所以可以在无公害食品和绿色食品的生产中使用。

近年来，该药也用于热带水果龙眼、荔枝等的生产中。

然而，随着我国龙眼出口量的逐年增长，国外对其进口的检验标准也更为严格。

国内目前还没有龙眼中阿维菌素残留量的测定方法，为控制龙眼中阿维菌素的残留污染和保护人民健康，探索一种适于龙眼中阿维菌素残留量检测的简便、快速、准确的分析方法是很有意义的。

2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
Waters 2695高效液相色谱仪(配荧光检测器)；碱性氧化铝固相萃取小柱(Sep-
pak Alumina B,12cc，2g)；高速匀质机；氮吹仪；离心机；电子天平等。

阿维菌素标准品(95%)；甲醇(色谱纯)；乙腈(分析纯)；N-甲基咪唑；三氟乙酸酐；水为二次蒸馏水。

2.2 标准溶液的配制
精密称量10.52mg阿维菌素原药于100mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，
配制成100mg/L的标准储备液。

2.3 色谱条件
色谱柱：Symmetry C18(150mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇-水(体积比
为90︰10)；柱温30℃；流速：1.0mL/min；荧光检测器，激发波长为365nm，发射波长为470nm；进样量：20μL。

2.4 标准曲线制作
取阿维菌素标准储备液，分别用甲醇稀释配制成0.05、0. 5、1.0、2.0、4.0mg/L 的标准工作溶液，经液相色谱测定后，建立了阿维菌素浓度与峰高的线性回归方程：Y=54.0X-42.002，相关系数R2=0.9997，进样量在0～80ng范围内呈良好的线
性关系。

2.5 分析步骤
称取均匀试样10g(精确至0.01g)于100mL烧杯中，加入50 mL乙腈，以
5000r/min匀质3min，过滤至装有7.0gNaCl的具塞量筒中，激烈振荡，避光静置10min，取乙腈相10 mL于15mL刻度试管中。

将碱性氧化铝柱用8mL乙腈预洗后，取10mL提取液过柱，自然流出，收集于
15mL具塞试管中，再用3mL乙腈洗涤，并收集于同一具塞试管中。

置于50℃水浴中，用氮气吹干，残存的微量水分在50℃烘箱中烘干，向试管中加入N-甲基咪唑-乙腈溶液(1︰1)100μL，涡旋混合30s后加入三氟乙酸酐-乙腈溶液(1︰
2)150μL，将试管塞住，轻轻振荡30s后加入750μL甲醇，静置30min，过
0.45μm微孔滤膜后，用反相高效液相色谱法测定。

3 结果与讨论
3.1 样品前处理法
目前，国内开发的检测阿维菌素类药物残留的方法大多是采用丙酮和水提取，再经二氯甲烷或石油醚等溶剂多次液-液分配及氟罗里硅土柱层析净化等步骤，然后用
紫外检测器[3，4] 或衍生后用荧光检测器检测[5]，过程比较烦琐。

本实验采用乙
腈提取，碱性氧化铝柱净化，处理方法快速简便，灵敏度高。

3.2 色谱分离
在上述色谱条件下，测得的阿维菌素标准溶液色谱图见图1，龙眼样品色谱图见图2，龙眼样品加标色谱图见图3。

从图中可以看出，目标物均得到很好的分离，且
峰形对称，保留时间适中。

图 1 阿维菌素标样色谱图
图 2 龙眼样品色谱图
图 3 龙眼样品加标色谱图
3.3 线性范围与检出限
用阿维菌素标准溶液配成5个不同浓度的标液(0.05、0.5、1.0、2.0、4.0mg/L)，在确定的色谱条件下，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线(见图4)，线性回归方程为： Y=54.04X-42.002 ，相关系数为R2=0.9997，进样量在0～
80ng范围内呈良好线性关系。

在该测定条件下，阿维菌素标准溶液保留时间约为7.4min，以3倍信噪比计，方法最低检出限为0.001mg/kg。

图 4 标准曲线图
3.4 准确度
在龙眼样品中加入一定体积的阿维菌素标准工作溶液(添加浓度分别为0.02mg/kg、0.08mg/kg和0.8mg/kg)，并设置空白样，在上述色谱条件下，采用优化的方法对这三个添加浓度进行测定，分别计算了添加回收率及其相对标准偏差。

添加回收率在88.0%～94.0%之间，变异系数为1.81%～3.55%，表明该方法具有良好的
准确性。

龙眼中阿维菌素添加回收率试验结果见表1。

表 1 龙眼中阿维菌素添加回收率试验结果(n=7)添加浓度(mg/kg)平均回收率(%)
标准偏差(%)变异系数CV(%)0.02
91.01.982.170.0891.21.651.810.891.73.263.55
3.5 精密度和重现性
精密吸取阿维菌素标准工作溶液(0.01 mg/L)20μL，按样品测定方法平行测定5次，阿维菌素色谱峰的保留时间波动小于0.1min，峰面积相对标准偏差(RSD)为
0.56%，表明阿维菌素保留时间的精密度符合分析要求，实验结果准确可靠，方法的精密度良好。

取同一批样品，加入0.2μg/mL的阿维菌素标准工作溶液1.0mL，按照样品制备方法平行制备5份，进行高效液相色谱法分析，测得各个样品色谱峰面积，其峰面积的相对标准偏差RSD为2.59%，保留时间的相对标准偏差RSD为0.68%，表明该方法重现性良好。

4 结论
联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO)所属的食品中农药残留立法委员会(CCRPF)规定了阿维菌素的每日允许摄入量为0.1μg/kg·bw，阿维菌素的最高残留限量(MRL)为5.0μg/kg；美国农业部下属的食品安全检验处(FSIS)规定的MRL值为0.02mg/kg，欧盟规定MRL值也为0.02mg/kg[6]。

我国还未制定出龙眼中阿维菌素的最高残留限量。

本实验方法的最低检出限为0.001mg/kg。

参照国外的阿维菌素限量标准，该方法完全可用于我国龙眼中阿维菌素残留量的分析。

参考文献
1 李俊锁，钱传范. 畜牧兽医学报, 1996, 27(6): 531-538
2 全国农药残留试验研究协作组. 农药残留量实用检测方法手册(第二卷). 北京: 化学工业出版社, 2001： 5
3 高国文. 农药科学与管理， 2005， 26(11)： 8-9
4 刘丰茂，王道全，明九雪等. 农药学学报， 2002, 4(4)： 67-70
5 马育松. 现代农药. 2006， 5(6) ： 22-24
6 张少华, 皇甫伟国, 何新华等. 农药, 2006, 45(4)： 263-264。