纤维素酶和木聚糖酶降解艾蒿纤维素工艺的优化

纤维素酶和木聚糖酶降解艾蒿纤维素工艺的优化
刘俊红;郑学辉;于婷婷;谢康;安丹丹;尹萌萌
【摘要】为探索纤维素酶和木聚糖酶降解艾蒿纤维素的最佳条件,以利于研究后续的乙醇发酵生产工艺,研究了不同因素对纤维素酶和木聚糖酶降解艾蒿粉的影响.结果表明:双酶降解艾蒿纤维素的最佳工艺条件为温度40℃、时间40h、pH 4.60、磷酸盐缓冲液4mL和双酶配比1:1.%The influences of Ph, time, temperature, phosphate buffer dosage, metal ion concentration and the ratio of cellulose to xylanase on degradation of cellulose from A. Argyi were studied to explore the optimum degradation conditions and to be beneficial to further study of productive technology of alcoholic fermentation. The results showed that the best conditions were as follows: temperature 40°C , time 40 h, Ph 4. 60, PBS dosage 4 Ml, cellulose-xylanase ratio 6: 6 (namely 1: 1).
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2012(040)005
【总页数】4页(P169-172)
【关键词】纤维素酶;木聚糖酶;艾蒿;纤维素;工艺优化
【作者】刘俊红;郑学辉;于婷婷;谢康;安丹丹;尹萌萌
【作者单位】河南城建学院生物工程系,河南平顶山467044;河南城建学院生物工程系,河南平顶山467044;河南城建学院生物工程系,河南平顶山467044;河南城建
学院生物工程系,河南平顶山467044;河南城建学院生物工程系,河南平顶山467044;河南城建学院生物工程系,河南平顶山467044
【正文语种】中文
【中图分类】S540
世界能源机构正经历由化石能源为主向以可再生能源为主的变革[1]。

生物质能与
人类的生活密切相关，是唯一可存储和运输的可再生能源，在能源系统中占有重要地位[2]。

利用富含纤维素的生物质原料制取燃料乙醇技术，越来越受到人们的广
泛关注[3-5]。

纤维素经水解可生成葡萄糖，易于发酵生产乙醇。

但纤维素的性质
稳定，在催化剂存在的情况下，水解反应才能显著地进行，因此，纤维素的降解效率直接关系到乙醇的得率[6-7]。

笔者以富含纤维素的禾本科植物艾蒿为研究对象，研究了pH、时间、温度、缓冲液用量、金属离子浓度及双酶的配比等因素对纤维素酶和木聚糖酶(简称双酶)降解艾蒿粉还原糖得率的影响[8]，旨在探索双酶降解艾蒿纤维素的最佳条件，以利于研究后续的乙醇发酵生产工艺。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料艾蒿(Argy Wormwood)，取自河南城建学院对面山脚，采集成熟艾蒿植株，洗净、烘干后用粉碎机粉碎，过60目筛后密封保存，随用随取。

用鼓风干燥箱干燥，温度设为70℃，避免温度过高。

1.1.2 试剂 DNS试剂、
2.0%稀盐酸、PBS(磷酸缓冲液)、纤维素酶和木聚糖酶。

1.1.3 仪器高速中药粉碎机、分样筛、电热压力蒸汽灭菌器、pH计、电子天平、
电热恒温水浴锅、低速离心机、紫外可见分光光度计和冷冻水浴恒温振荡器等。

1.2 方法
1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制[9] 将适量葡萄糖粉末放在电热鼓风干燥箱中75℃干燥至恒重，称取2g干燥后的葡萄糖配制成2mg/mL的葡萄糖标准溶液。

分别取
不同葡萄糖标准溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、
1.4mL和1.6mL于试管中，用蒸馏水稀释至2mL，然后依次加入DNS试剂各
2mL，充分混匀，并在沸水浴中煮沸6～8min，取出冷却至室温，用紫外可见光
分光光度计在550nm下测定吸光度值，绘制葡萄糖标准曲线。

得回归方程
y=13.109x+0.0295，R2=0.9935。

1.2.2 艾蒿粉糖化率测定及分析方法称取1 g过60目筛的艾蒿秸秆粉，加入2.0%的稀盐酸10mL(初始液固比为10)，在120℃条件下预处理60min后，取出冷却至室温，加缓冲液和金属离子并调整试样的pH值，加入双酶，通过设置不同的温度梯度、时间梯度进行多组酶解糖化反应。

水解液经3 600r/min离心7min后取上清液，按一定比例稀释，取2mL稀释液到小试管中，加入DNS试剂2mL，充分混匀后沸水浴7min，冷却后于550nm下测定吸光值，计算还原糖得率，并代入下式得糖化率：
糖化率=
注：0.9为计算误差。

1.2.3 不同因素对艾蒿粉糖化率的影响
1) 温度。

在时间40h、pH4.60、PBS用量3mL、双酶配比6∶6、Mg2+浓度任
意(金属离子的用量很小，保持低浓度即可，下同)，考察不同温度(25～60℃，梯
度增加值为5℃)对艾蒿粉糖化率的影响。

2) 时间。

在温度50℃、pH4.60、PBS用量3mL、双酶配比6∶6、Mg2+浓度任意，考察不同时间(8～64h，梯度增加值为8h)对艾蒿粉糖化率的影响。

3) pH。

在温度50℃、时间40h、PBS用量3mL、双酶配比6∶6、Mg2+浓度任
意，考察不同pH(3.4～6.2，递增梯度为0.4)对艾蒿粉糖化率的影响。

4) PBS用量。

在温度50℃、时间40h、pH4.60、双酶配比6∶6、Mg2+浓度任意，考察不同PBS用量(0～7mL，梯度递增为1mL)对艾蒿粉糖化率的影响。

5) 双酶配比。

在温度50℃、时间40h、pH4.60、PBS用量3mL、Mg2+浓度任意，考察不同双酶配比(双酶配比梯度包括2∶6，3∶6，4∶6，5∶6，6∶6，6∶5，6∶4，6∶3，6∶2)对艾蒿粉糖化率的影响。

6) Mg2+浓度。

在温度50℃、时间40h、pH4.60、PBS用量3mL、双酶配比为6∶6的条件下，考察不同Mg2+浓度(0～0.14，梯度递增0.02)对艾蒿粉糖化率的影响。

1.2.4 双酶降解艾蒿纤维素工艺条件的正交试验设计在单因素试验的基础上，选取温度、时间、pH、PBS用量及双酶比例为试验因子，进行正交试验设计，各试验
因素及水平见表1。

表1 不同因素对艾蒿粉糖化率影响的正交试验设计因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experimental design水平Level因素 Factor温
度/℃Tem perature时间/hTimepHPBS用量/mLPBSdosage双酶配比(木/
纤)Doubleenzymeratio140244.2026∶4245324.6036∶5350405.0046∶64554 85.4055∶6
2 结果与分析
2.1 不同因素对艾蒿粉糖化率的影响
2.1.1 温度由图示可见，随着温度逐渐增高，酶解糖化率随之增大，当温度达到50℃时，酶解总糖化率达到最大值(61.99%)，即为该反应体系酶的最适反应温度。

当温度继续上升时，酶解糖化率开始下降。

在酶催化反应中，根据生物酶的化学性质，温度既能影响化学反应速度本身，又能影响酶的稳定性、构象和催化机制[10]。

2.1.2 时间从图示可见，酶解糖化率随时间的延长而提高，但增长率不断减小，反
应40 h后，总糖化率达到56.53%，以后基本稳定不变。

对于某一定用量的酶，
糖化率与时间呈正相关性，这与酶促反应的动力学方程基本一致。

在反应的前段时间内，酶与底物形成复合物的浓度较小，没有反馈抑制的作用；反应持续进行时，随着糖浓度的不断增加，反馈抑制增强，正向反应的速率降低[10]。

图示不同因素影响下艾蒿粉的糖化率Fig. Saccharification yields of A. argyi affected by various factors
2.1.3 pH 由图示可见，试样pH值对双酶糖化反应有显著的影响，呈先平缓上升
然后较快下降的变化趋势。

当试样pH为4.60时，酶解糖化率达最大值69.94%。

因此，pH4.60为该反应体系酶的最适pH。

过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。

当pH改变不太剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。

pH影响了底物的解离状态，或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物；pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化，使酶活性降低；也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物[10]。

2.1.4 PBS用量由图示可见，随着PBS用量的逐渐增大，酶解糖化率随之增大，
当PBS用量达到3 mL时，酶解总糖化率达到最大值72.91%，即3mL为该反应
体系酶的最适PBS用量。

当PBS用量继续增大时，酶解糖化率开始下降。

2.1.5 双酶配比由图示可见，当双酶配比为6∶6(即1∶1)时，酶解糖化率最大。

随着其中任何酶量的减少，糖化率都降低。

说明，纤维素酶和木聚糖酶在降解艾蒿秸秆的过程中有互补作用。

2.1.6 Mg2+浓度由图示可见，Mg2+浓度对酶解总糖化率影响不显著，随着离子浓度的递增，总糖化率与对照(Mg2+浓度为0)相比，基本维持在同一水平上，说明，Mg2+浓度对酶活性的影响很小。

2.2 双酶降解艾蒿纤维素的最佳工艺条件
由表2可知，温度和双酶配比的极差R分别为7.530和6.412，数值较大，说明，温度和双酶配比是双酶降解艾蒿纤维素最敏感的因素，其波动会使结果发生较大变化；PBS用量是最不敏感的因素(R=1.077)，其变动不会引起糖化率的显著变化。

因此，可结合具体情况，选择适宜的双酶降解艾蒿纤维素的条件。

根据各试验因子的均值可以看出，温度40℃、时间40h、pH4.60、PBS用量
4mL和双酶配比6∶6为双酶降解艾蒿纤维素的最佳工艺条件。

表2 不同因素影响艾蒿粉糖化率的正交试验结果Table 2 Orthogonal test results of effects of different factors on saccharification yields of A. argyi编号No.温度/℃Temperature时间/hTimepHPBS用量/mLPBSdosage双酶配比(木/纤)Doubleenzymeratio糖化率
/%Saccharificationyield140244.2026∶455.43240324.6036∶558.03340405.0 046∶664.87440485.4055∶657.21545244.6045∶657.81645324.2056∶662.7 1745405.4026∶557.51845485.0036∶455.49950245.0056∶551.261050325.4 046∶448.791150404.2035∶653.771250484.6026∶658.201355245.4036∶65 1.621455325.0025∶651.261555404.6056∶452.041655484.2046∶550.50K12 35.54216.12222.41222.40211.75T=886.50K2233.52220.79226.08218.91217. 30K3212.02228.19222.88221.97237.40K4205.42221.40215.13223.22220.05k 158.88554.03055.60255.60052.938k258.38055.19756.52054.72854.325k353. 00557.04755.72055.49259.350k451.35555.35053.78255.80555.013R7.5303. 0172.7381.0776.412
2.3 验证试验
根据单因素试验结果分析得出，最佳双酶降解条件为温度50℃、时间40h、pH 4.60、PBS用量3mL，双酶配比6∶6(即1∶1)，其与正交试验对应的工艺条件为
A3B3C2D2E3，通过极差分析发现，正交试验最佳组合为A1B3C2D4E3，但该组
合不在16个工艺条件组合中，而16个工艺条件组合中A1B3C3D3E3组合的降
解率最高，为64.87%。

验证试验结果表明，A1B3C3D3E3的降解效果明显优于
单因素试验的最佳组合A3B3C2D2E3(降解率55.43%)和16个组合外的组合
A1B3C2D4E3(降解率60.47%)，说明，A1B3C3D3E3为双酶降解艾蒿纤维素的
最佳工艺条件。

3 小结
单因素试验和正交试验结果表明，双酶降解艾蒿纤维素的最佳工艺条件为
A1B3C3D3E3，即温度40℃、时间40h、pH4.60、PBS用量4mL、双酶配比(木聚糖酶：纤维素酶)6∶6(即1∶1)，在最佳工艺条件下，双酶降解率可达64.87%。

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