利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌耐药机制分析

ＤＯＩ：
１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．０８．１３
·临床实验研究·
利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌耐药机制分析
高硕，周万青，朱宏，周辉，张燕，张之烽，曹小利，沈瀚（南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京２１０００８）
摘要：目的　调查临床分离金黄色葡萄球菌对利奈唑胺的耐药情况及耐药机制。

方法　用Ｖｉｔｅｋ２系统ＧＰ６７卡对２０１９年１月至１２月南京鼓楼医院临床分离９０５株金黄色葡萄球菌进行药敏试验，对检出的利奈唑胺耐药菌株用Ｅ ｔｅｓｔ法复测利奈唑
胺最低抑菌浓度（ＭＩＣ）；用ＰＣＲ扩增及测序技术分析利奈唑胺耐药决定基因ｃｆｒ、ｏｐｔｒＡ及２３ＳｒＲＮＡ基因Ｖ区；对菌株基因组
ＤＮＡ进行全基因组测序分析，对耐药基因、毒力基因进行生物信息学分析；用多位点序列分型（ＭＬＳＴ）技术获得菌株ＳＴ分型。

结果　９０５株金黄色葡萄球菌检出１株（０．１％）利奈唑胺耐药株（ＭＩＣ为１６ｍｇ／Ｌ），该菌株除对万古霉素和复方磺胺甲 唑敏
感外，对其余常用抗菌药物均耐药。

ＰＣＲ及测序技术显示该菌株携带ｃｆｒ基因，２３ＳｒＲＮＡＶ区存在Ｔ２３３７Ｇ和Ｃ２３７０Ｇ核苷酸
突变位点；
全基因组序列分析显示基因组包含碱基数为２９４９４１１ｂｐ，总基因数为３０２３个，包含５９个ｔＲＮＡ编码基因以及７个完整的ｒＲＮＡ基因编码操纵子，获得ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＪＡＡＮＹＯ０００００００００，且该菌株携带包括ｃｆｒ在内的多种耐药决定基因和毒力基因；ＭＬＳＴ分型为新型ＳＴ５９８５。

结论　利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌临床分离率较低。

检出由ｃｆｒ基因和２３ＳｒＲＮＡＶ区突变介导的新ＳＴ型利奈唑胺耐药株。

关键词：金黄色葡萄球菌；利奈唑胺耐药；ｃｆｒ基因；２３ＳｒＲＮＡ突变；全基因组测序
中图分类号：
Ｒ４４６．５ 文献标志码：ＡＡｎａｌｙｓｉｓｏｎｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｉｎｅｚｏｌｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ
ＧＡＯＳｈｕｏ，
ＺＨＯＵＷａｎｑｉｎｇ，ＺＨＵＨｏｎｇ，
ＺＨＯＵＨｕｉ，ＺＨＡＮＧＹａｎ，ＺＨＡＮＧＺｈｉｆｅｎｇ，ＣＡＯＸｉａｏｌｉ，
ＳＨＥＮＨａｎ（
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，
ＮａｎｊｉｎｇＤｒｕｍＴｏｗｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ，
ｔｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，
Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００８，Ｊｉａｎｇｓｕ，
Ｃｈｉｎａ
）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｔｏｌｉｎｅｚｏｌｉｄａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａ ｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｔｏｔａｌｏｆ９０５ｓｔｒａｉｎｓｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＮａｎｊｉｎｇＤｒｕｍＴｏｗｅｒＨｏｓｐｉｔａｌｄｕｒｉｎｇＪａｎｕａｒｙ２０１９ａｎｄＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１９ｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｈｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｂｙｔｈｅＧＰ６７ｃａｒｄｓｏｆＶｉｔｅｋ２ｓｙｓｔｅｍ，
ａｎｄｔｈｅｓｃｒｅｅｎｅｄｌｉｎｅｚｏｌｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）
ｏｆｌｉｎｅｚｏｌｉｄｂｙｔｈｅＥ ｔｅｓｔ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｇｅｎｅｓｏｆｌｉｎ ｅｚｏｌｉｄｓｕｃｈａｓｃｆｒ，
ｏｐｔｒＡａｎｄｔｈｅｆｉｆｔｈｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｉｏｎｏｆ２３ＳｒＲＮＡｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，
ａｎｄｔｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｔｈｅｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）
ｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ（ＳＴ）
ｏｆｔｈｅｉｓｏ ｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｏｎｌｙｏｎｅ（０．１％
）ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｗｉｔｈ１６ｍｇ／ＬｏｆＭＩＣｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ９０５ｓｔｒａｉｎｓｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ．ＴｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｔｏｖａｎｃｏｍｙｃｉｎａｎｄＳＭＺ ＴＭＰｂｕｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｏｔｈｅｒａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｅｄｃｏｍｍｏｎｌｙ．ＰＣＲａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｔｒａｉｎｃａｒｒｉｅｄｃｆｒｇｅｎｅ，
ａｎｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＴ２３３７ＧａｎｄＣ２３７０Ｇｉｎｔｈｅｆｉｆｔｈｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｉｏｎｏｆ２３ＳｒＲＮＡ．ＴｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｏｍｅＤＮＡｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆ２９４９４１１ｂｐ，
ａｎｄｃｏｎｔａｉｎｅｄ３０２３ｇｅｎｅｓ，
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ５９ｔＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓａｎｄ７ｃｏｍｐｌｅｔｅｒＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇｏｐｅｒｏｎｓ．Ｔｈｉｓｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｄｅｐｏｓｉ ｔｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋ，
ａｎｄｔｈｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＪＡＡＮＹＯ０００００００００ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｓｔｒａｉｎｃａｒｒｉｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｇｅｎｅｓｓｕｃｈａｓｃｆｒｇｅｎｅａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓ．ＭＬＳＴｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｅｓｔｒａｉｎａｓａｎｅｗｔｙｐｅｏｆＳＴ５９８５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｌｉｎｅｚｏｌｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｉｓｌｏｗ，
ａｎｄａｎｅｗＳＴｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｏｆｌｉｎｅｚｏｌｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｃｆｒｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｉｆｔｈｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｉｏｎｏｆ２３ＳｒＲＮＡｉｓｆｏｕｎｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ；ｌｉｎｅｚｏｌｉｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｃｆｒｇｅｎｅ；
２３ＳｒＲＮＡｍｕｔａｔｉｏｎ；
ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
利奈唑胺作为 唑烷酮类抗菌药物，广泛应用于革兰阳性球菌引起的严重感染，是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓａｕｒｅｕｓ，
ＭＲＳＡ）的一个重要选择［１
］。

然而，在全球范围内，利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌感染病例
相继出现，给临床治疗带来严峻挑战［２
］。

目前已知
的利奈唑胺耐药主要机制是２３ＳｒＲＮＡ基因Ｖ区核苷酸突变、核糖体Ｌ３和（或）Ｌ４突变以及菌株携带氯霉素－氟甲砜霉素耐药基因（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ｆｌｏｒ
ｆｅｎｉｃｏｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，
ｃｆｒ）［３
］。

近年发现，介导粪肠球菌
基金项目：南京市医学科技发展资金（ＺＫＸ１８０１６，ＱＲＸ１７１４３，ＹＫＫ１８０９１）。

作者简介：高硕，１９８７年生，女，主管技师，硕士，主要从事临床微生物检验及相关耐药机制研究。

通信作者：沈瀚，主任技师，硕士，Ｅ ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｈａｎ１０３６６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。

利奈唑胺耐药的决定基因ｏｐｔｒＡ［４
］在凝固酶阴性葡萄球菌中也有检出［５
］，以及由新型ｐｏｘｔＡ基因介导的利奈唑胺耐药ＭＲＳＡ被检出［６
］，进一步揭示革兰阳性菌对利奈唑胺耐药机制的多元化。

本课题组前期研究发现，获得ｃｆｒ基因或２３ＳｒＲＮＡＧ２５７６Ｔ突变是导致凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺耐药的主要机制［７
］，并存在江苏地区内的克隆传播。

美国ＬＥＡＤＥＲ项目２０１１—２０１５年数据显示，金黄色葡萄球菌利奈唑胺不敏感率为０．１％［８
］。

２０１８年ＣＨＩＮＥＴ中国细菌耐药监测结果显示，
甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｏａｇｕｌａｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，
ＭＲＣＮＳ）和甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌（ｍｅｔｉｃｉｌｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃｏ ａｇｕｌａｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，
ＭＳＣＮＳ）对利奈唑胺的耐药率分别为０．５％和０．１％，未检出利奈唑胺耐药的ＭＲＳＡ［９
］。

而本课题组在对我院临床分离金黄色葡萄球菌药敏监测中检出１株利奈唑胺耐药ＭＲ ＳＡ菌株，并利用全基因组测序技术分析其对利奈唑胺的耐药机制，现报道如下。

１　材料和方法
１．１　菌株　收集南京大学医学院附属鼓楼医院２０１９年１月至１２月临床分离非重复金黄色葡萄球菌９０５株，
主要分离自痰液（５２％）、分泌物（２９％）、血液样本（７％）及其他类型标本（１２％）。

所有菌株均经Ｖｉｔｅｋ２ＣｏｍｐａｃｔＧＰ板卡鉴定并经Ｖｉｔｅｋ质谱仪复核。

金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２９２１３、ｃｆｒ基因阳性对照头状葡萄球菌ＳＡ１０１０６为本实验室保存［１０
］。

１．２　主要试剂与仪器　Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动鉴定仪及配套ＧＰ鉴定卡、ＧＰ６７药敏卡、ＶｉｔｅｋＭＳ（法
国生物梅里埃公司），利奈唑胺Ｅ ｔｅｓｔ试纸条（郑州
安图生物公司），ＤＮＡ提取试剂盒及胶回收试剂盒（北京天根公司），２×ＴａｑＭｉｘ（ＤＢＩ公司），ＬＢ肉汤（科玛嘉公司），ＰＣＲ引物由上海生工公司合成；２７２０ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＣＲ仪、ＡＢＩ３７３０ＸＬ基因测序仪（美国ＡＢＩ公司）；Ｇｅｌ ＤｏｃＸＲ型凝胶成像分析系统（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司）。

１．３　药敏试验　用Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ配套ＧＰ６７药
敏卡检测菌株对常规药物的敏感性。

用Ｅ ｔｅｓｔ法复测利奈唑胺耐药菌株对利奈唑胺的最低抑菌浓度
（ＭＩＣ），判定标准参照美国临床和实验室标准化协会（ＣＬＳＩ）２０１９年标准［１１
］。

１．４　ＤＮＡ提取　挑取纯培养菌落接种至ＬＢ液体培养基，３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎ培养１６ｈ，用ＤＮＡ提取试剂盒提取菌液基因组ＤＮＡ，按试剂盒说明书进行操作。

所提核酸用于全基因组测序及基因扩增。

１．５　ＰＣＲ扩增和序列分析　参照文献［７
］合成２３ＳｒＲＮＡ第Ｖ功能区基因、
ｃｆｒ基因以及ｏｐｔｒＡ基因，引物序列见表１。

反应体系为５０μＬ：２×ＴａｑＭｉｘ
２５μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，
上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各２μＬ，ｄｄＨ２
Ｏ１９μＬ。

ＰＣＲ反应条件：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，共３０个循环；
７２℃７ｍｉｎ。

ＰＣＲ产物行１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，阳性扩增产物经电泳后切胶回收，用柱层析法纯化后用ＡＢＩ３７３０ＸＬ基因测序仪进行Ｓａｎｇｅｒ双向测序（由上海生工公司完成），正、反向测序片段采用ＤＮＡＭＡＮ８软件拼接，结果经ＢＬＡＳＴ与ＧｅｎＢａｎｋ进行比对。

表１　靶基因ＰＣＲ引物序列及产物大小
目的基因
引物序列（
５′→３′）产物长度（ｂｐ）２３ＳｒＲＮＡＦ：
ＧＣＧＧＴＣＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧ
３９０Ｒ：ＡＴＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＧＴＡＣＴＡ
ｃｆｒＦ：ＴＧＡＡＧＴＡＴＡＡＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＡＧＴＣＡ７４６Ｒ：ＡＣＣＡＴＡＴＡＡＴＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣｏｐｔｒＡ
Ｆ：ＡＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＡＡＣＴＡＡ１３９５
Ｒ：
ＡＴＣＡＡＣＴＧＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡ１．６　
全基因组测序分析　委托上海泽塔生物科技
公司用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００测序系统进行全基因组ＤＮＡ测序。

简要步骤：对样本ＤＮＡ进行双向（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ，ＰＥ）测序，构建４５０ｂｐ文库；对测序结果进行质量剪切后，用ＭｉｃｒｏｂｅＴｒａｋｒｐｌｕｓｖ．０．９．１软件对序列进行拼接，得到最优的组装结果。

用Ｇｅｎ ｅＭａｒｋＳ＋ｖ．４．１１基因注释软件对测序结果进行预测。

将预测得到的基因序列分别与ＫＥＧＧ、ＣＯＧ、ＧＯ数据库进行ＢＬＡＳＴ比对，获得预测基因的注释信息。

利用ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ网站（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）
中的ＬＲＥ Ｆｉｎｄｅｒ１．０、ＲｅｓＦｉｎｄｅｒ３．２、ＶｉｒｕｌｅｎｃｅＦｉｎｄｅｒ及ＰｌａｓｍｉｄＦｉｎｄｅｒ软件对耐药基因、毒力基因、利奈唑胺耐药相关突变及质粒分型进行预测分析。

１．７　多位点序列分型（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ，
ＭＬＳＴ）　用ＰＣＲ方法进行菌株ＭＬＳＴ分析［１２］。

参照金黄色葡萄球菌ＭＬＳＴ数据库（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．
ｏｒｇ／ｓａｕｒｅｕｓ／）中引物序列，合成金黄色葡萄球菌７个管家基因ａｒｃ、ａｒｏ、ｇｌｐ、ｇｍｋ、ｐｔａ、ｔｐｉ和ｙｑｉ扩增引
物，并依据网站条件进行ＰＣＲ扩增和测序。

ＰＣＲ反应体系及序列分析同１．５。

通过将测序序列与数据库进行比对，获得菌株ＭＬＳＴ型别。

ｐｔａ等位基因型未在数据库中获得匹配，将序列及测序文件递交至Ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ｐｒｏｆｉｌｅｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ数据库（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．
ｏｒｇ／ｂｉｇｓｄｂｄｂ＝ｐｕｂｍｌｓｔ＿ｓａｕｒｅｕｓ＿ｓｅｑｄｅｆ）以获得新的等位基因编号及ＳＴ型别。

２　结果
２．１　利奈唑胺耐药菌株筛选　９０５株金黄色葡萄球菌对青霉素、环丙沙星、红霉素、克林霉素、四环素、
复方磺胺甲 唑和左氧氟沙星的耐药率分别为
９７．２％、３８％、５９．７％、２９．３％、３４．７％、５．９％和３８．１％，未检出万古霉素不敏感菌株，ＭＲＳＡ检出率为
４９．８％，检出１株（０．１％）利奈唑胺耐药菌株（实验室编号ＳＡ１２０９５）。

该菌株对万古霉素和复方磺胺
甲 唑敏感，对青霉素、苯唑西林、环丙沙星、红霉素、克林霉素、四环素及左氧氟沙星均耐药；Ｅ ｔｅｓｔ检测利奈唑胺ＭＩＣ值为１６ｍｇ／Ｌ。

２．２　耐药基因检测结果　ＰＣＲ结果显示ＳＡ１２０９５携带ｃｆｒ基因，未检出ｏｐｔｒＡ基因。

见图１。

经测序，
２３ＳｒＲＮＡＶ区发生Ｔ２３３７Ｇ和Ｃ２３７０Ｇ２个核苷酸位点的突变。

注：Ｍ，２０００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｋｅｒ；１，ｃｆｒ基因阳性对照（ＳＡ１０１０６）；２，ｃｆｒ基因（ＳＡ１２０９５菌株）；３，ｏｐｔｒＡ基因（ＳＡ１２０９５菌
株）；４，２３ＳｒＲＮＡＶ区（ＳＡ１２０９５菌株）；５，２３ＳＲＮＡＶ区（ＡＴＣＣ２９２１３菌株）。

图
１　耐药基因扩增产物电泳分析２．３　基因组概述　ＳＡ１２０９５基因组大小为
２９４９４１１ｂｐ，ＧＣ含量为４８．５％，总基因数为３０２３个，基因组含有２８７６个编码序列、５９个ｔＲＮＡ编码
基因以及７个完整的ｒＲＮＡ基因编码的操纵子。

耐药基因预测分析显示，该菌株携带ｃｆｒ、ｎｏｒＡ、ａａｄＤ、
ｓｐｃ、ａａｃ（６′） ａｐｈ（２′′）、ｅｒｍ（Ａ）、ｔｅｔ（Ｋ）、ｂｌａＺ、ｍｅｃＡ及ｌｎｕ（Ａ）。

毒力基因主要有ｓａｋ、ｓｃｎ、ｈｌｇＡ、ｈｌｇＢ、
ｈｌｇＣ、ｌｕｋＤ、ｌｕｋＥ、ｓｅａ、ｓｅｃ、ｓｅｌ、ｓｅｍ、ａｕｒ、ｓｐｌＡ及ｓｐｌＢ。

质粒分型预测主要为携带Ｉｎｃｒｅｐ７ａ、Ｉｎｃｒｅｐ５ａ、
Ｉｎｃｒｅｐ１９及Ｉｎｃｒｅｐ１６的质粒。

全基因序列提交至ＮＣＢＩ数据库，ＧｅｎｅＢａｎｋ号为ＪＡＡＮＹＯ０００００００００。

２．４　ＭＬＳＴ结果　经ＰＣＲ扩增及测序，ＳＡ１２０９５菌株管家基因ｐｔａ序列与数据库中ｐｔａ２４９相比存在１
个碱基突变（Ａ３９５３６Ｔ）。

将序列上传至金黄色葡萄球菌ＭＬＳＴＳｅｑｕｅｎｃｅ／ｐｒｏｆｉｌｅｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ数据库，获得新的等位基因型为ｐｔａ７３１，获得７个位点（ａｒｃ／ａｒｏ／ｇｌｐ／ｇｍｋ／ｐｔａ／ｔｐｉ／ｙｑｉ）的等位基因编码依次为１、４、
１、４、７３１、１、１０，上传至上述数据库获得ＳＡ１２０９５菌株ＳＴ型为新型ＳＴ５９８５。

３　讨论
本文对我院２０１９年度临床分离金黄色葡萄球菌进行药敏监测，发现１株（０．１％）利奈唑胺耐药菌
株，分离率与文献报道相近［８］。

虽然目前本院临床分离金黄色葡萄球菌对利奈唑胺耐药率较低，但仍需加强监控，早期发现并实施可能的院内播散流行的阻断措施。

目前报道的利奈唑胺耐药ＭＲＳＡＳＴ分型主要有ＳＴ３６［１３］及ＳＴ５［１４ １５］等，本文分离ＳＡ１２０９５菌株ｐｔａ等位基因为新的基因型，并被
ＭＬＳＴ数据库确认为新型ＳＴ５９８５。

利奈唑胺主要通过与细菌５０Ｓ核糖体亚基的肽基转移酶中心（ｐｅｐｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｃｅｎｔｅｒ，ＰＴＣ）结合，抑制蛋白质的合成从而发挥抗菌作用。

细菌对利奈唑胺耐药的主要机制之一是细菌２３ＳｒＲＮＡＶ区点突变，导致药物与靶位亲和力减低，其中以
Ｇ２５７６Ｔ点突变发生率最高［２，７］。

姚伟明等［１６］对利奈唑胺诱导耐药的ＭＲＳＡ菌株进行全基因组测序
发现，２３ＳｒＲＮＡＶ区发生Ｇ２４４７Ｔ突变。

Ｗｕ等［１７］对临床患者血液中检出的利奈唑胺耐药ＭＲＳＡ进行全基因组测序分析，发现存在２３ＳｒＲＮＡＶ区
Ｇ２５７６Ｔ和Ｇ２２３４Ａ位点突变。

但除Ｇ２５７６Ｔ外，对于其他突变位点与利奈唑胺耐药的相关研究数据仍
缺乏。

不同于此前的报道，我们通过ＰＣＲ联合Ｓａｎｇｅｒ测序技术以及全基因组测序技术发现ＳＡ１２０９５菌株存在２３ＳｒＲＮＡＶ区Ｔ２３３７Ｇ和
Ｃ２３７０Ｇ２个新的核苷酸突变位点。

由于该菌株同时检出ｃｆｒ基因而未检出ｏｐｔｒＡ基因，我们推测，
ＳＡ１２０９５菌株对利奈唑胺耐药与菌株携带ｃｆｒ基因
有关。

近年来由ｃｆｒ介导的利奈唑胺耐药菌株在一些国家引起暴发流行［１８］。

有报道显示ｃｆｒ基因位于
ｐＬＲＳＡ４１７质粒上，因此需警惕耐药性在不同种属细菌之间的传播［１５］。

本院此前检出ｃｆｒ基因介导利
奈唑胺耐药的头状葡萄球菌的流行［１０］。

最近发现江苏地区流行的耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌主要由ｃｆｒ基因和２３ＳｒＲＮＡⅤ区Ｇ２５７６Ｔ突变造成，并存在头状葡萄球菌和人葡萄球菌的跨地区克隆播散［７］。

因此，对于ＳＡ１２０９５菌株中ｃｆｒ基因的来源和定位研究将为可能的耐药基因传播及防控奠定理论基础。

另外，全基因组测序分析提示ＳＡ１２０９５菌株同时携带ｔｅｔ（Ｋ）、ｂｌａＺ、ｍｅｃＡ等基因，并与菌株对四环素、青霉素及苯唑西林耐药表型相一致。

由此可见，全基因组测序分析可为耐药基因研究提供支持性数据。

研究表明，利奈唑胺暴露可能是利奈唑胺耐药菌株感染的危险因素［１３］，亦有耐药菌株在未使用过利奈唑胺患者的样本中检出的报道［１４］。

本文菌株分离自多发性骨髓瘤合并肺部感染患者痰液样本，该患者在ＳＡ１２０９５检出前１５ｄ有连续７ｄ的利奈唑胺使用史。

因此，我们推测ＳＡ１２０９５耐药性的产生可能与利奈唑胺暴露有关。

本文对耐药监测中所检出的１株利奈唑胺耐药
ＭＲＳＡ进行全基因组测序并结合ＰＣＲ及测序技术，揭示该菌株是由ｃｆｒ基因介导的利奈唑胺耐药，并且
为新型ＳＴ型ＭＲＳＡ（ＳＴ５９８５），提示目前流行的利奈唑胺耐药ＭＲＳＡ仍为地区性散发。

但携带可经质粒介导传播的ｃｆｒ基因是可能造成其水平传播的危险因素，因此，建议临床密切监测耐药菌株的出现，并与医院感染控制部门合作，及时阻断进一步播散。

４　参考文献
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（收稿日期：２０２０ ０５ ０６）
（本文编辑：刘群）。