河南烟草根际短体线虫鉴定及其致病性分析

Vol49 No
Jan 2021
第49卷第1期2021年1月西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of Northwest A&F University(Nat. Sci. Ed.)
网络出版时间:2020-07-08 09：36 DOI ：10. 13207/j. cnki. jnwafu. 2021 01 010网络出版地址：https ://kns . cnki. net/kcms/detai//61. 1390. S. 20200707. 1537. 010. html
河南烟草根际短体线虫鉴定及其致病性分析
王硕，刘-琨，夏艳辉，郝鹏辉，王珂，李洪连，李 宇
(河南农业大学植物保护学院，河南郑州450002)
［摘要"【目的】明确从河南省南阳市烟草根际采集到的一种短体线虫的种类及其对烟草的致病性，为烟草根
腐线虫病害的识别与有效防治提供理论依据)【方法】采用形态学与分子生物学相结合的方法,对分离自河南省南阳
市烟草根际的一种短体线虫进行鉴定，并采用温室盆栽接种的方法测定其对烟草的致病性。

【结果】形态学分析发 现，待鉴定短体线虫与咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae )的形态特征较为一致)rDNA-ITS 和rDNA 28S D2〜D3 序列分析发现，该线虫种群与NCBI 数据库中的咖啡短体线虫序列具有高度相似性。

基于rDNA-ITS 和rDNA 28S
D2〜D3序列构建的贝叶斯进化树显示，该短体线虫与其他咖啡短体线虫位于同一高度支持的分支。

因此，将从河南 省南阳市烟草根际采集到的短体线虫鉴定为咖啡短体线虫。

接种咖啡短体线虫75 d 后的烟株生长缓慢，植株矮小， 叶片黄化萎蔦，根部出现褐色病斑甚至坏死腐烂，咖啡短体线虫在烟草根际的繁殖率达到5.81O 【结论】河南省南阳
市烟草根腐线虫病病原为咖啡短体线虫，其对烟草具有较强的致病性。

［关键词］烟草根际；咖啡短体线虫；线虫致病性；河南
［中图分类号］S432.4+ 5 ［文献标志码］A ［文章编号］1671-9387(2021)01-0085-09
Identification and pathogenicity of a root-lesion nematode
species on tobacco in Henan
WANG Shuo,LIU Yankun,XIA YanhufHAO Penghui ,
WANG Ke,LI Honglian,LI Yu
(College of Plant Protection , Henan Agricultural University Zhengzhou, Henan 450002 , China)
Abstract : ［Objective ! The research confirmed the species and pathogenicity of a root-lesion nematode
collected from tobacco (.Nicotiana tabacum ) in Nanyang , Henan to provide basis for the identification and e f ect8vecontroloftobaccoroot-les8onnematoded8seases. 【Method 】 Aroot-l2sionn2matod2was2xtract2d
fromth2rhizosph2r2oftobaccoinNanyang (H2nanandth2n2matod2wasid2ntifi2dbas2donmorphologi- caland mol2cularbiologicalt2chnology.Th2pathog2nicityofth2root-l2sionn2matod2totobaccowasalso tested via pot experiment in a greenhouse. ［Result ! Base on the morphological analysis , the root-lesion nematode collected in this study was identified as Pratylenchus coffeae. The rDNA-ITS and rDNA 28S
D2—D3 sequences of the root-les8on nematode from tobacco had h8gh8dent8tes w8ththesequencesof
P . coffeae in the GenBank database. Bayesian tree inferred from rDNA-ITS and rDNA 28S D2 — D3 se ­
quences showed that the root-lesion nematode formed a highly supported clade with other P . coffeae pop- ulations.Both morphologicaland molecularstudiesrevealedthattheroot-lesionnematodeextractedfrom
rhizosphere of tobacco in Nanyang , Henan was P . coffeae . After inoculation with P . coffeae ? the tobacco
［收稿日期& 2019-12-31
［基金项目&国家公益性行业(农业)科技专项(201503112)；河南省高等学校重点科研项8(0A210022)
［作者简介&王 硕(1994 — )，男，河南商丘人，硕士，主要从事植物病原线虫学研究。

E-mail ： wssxxl220@ 163. com
［通信作者&李 宇(1985 —)，男，河南信阳人，讲师，博士，主要从事植物病原线虫学研究。

E-mail ：liyuzhibao @henau. edu. cn
86西北农林科技大学学报(自然科学版)第49卷
growth and height were reduced,leaves became yellow,and the roots presented brown spots and heavily rotted.The reproductive factor(Rf)of P.coffeae reached 5.81after inoculated tobacco for75days. [Conclusion!The species of root-lesion nematode infected tobacco in Nanyang,Henan was P.coffeae,and thasstrongpathogen8c8tytotobacco.
Key words:rhizosphere of tobacco；Pratylenchus coffeae；nematode pathogenicity；Henan
烟草(N4ohQna tabacum)是我国一种重要的经济作物，对国家财政税收具有十分突出的贡献%1。

河南省自然条件优越，是我国重要的烟叶生产区
位于河南西南部的南阳，因其突出的区域优势，为烟草生长提供了优越的环境条件，是河南省重要的烟草种植区3)烟草在生长过程中会受到多种病原物的侵染危害，造成不同程度的经济损失，其中植物寄生线虫是烟草上重要的病原物之一。

短体属线虫(Pratylenchus)是一种迁移性的植物根内寄生线虫，寄主范围广泛，现已经报道了100多个有效种对部分短体线虫可寄生在烟草根部，造成烟草根组织变褐腐烂，给烟草生产带来了重大损失%1，10。

刘学敏等％&报道，短体线虫在吉林烟草种植区发生危害，但并未对采集到的线虫种群进行详细的鉴定，也未能确定发生在吉林省烟草上的短体线虫种类。

刘修勇等%11报道山东省烟草上有落选短体线虫(P.neglects)寄生。

焦永吉%12发现河南省烟草种植区有桑尼短体线虫(P.thornet)的发生危害。

李建立等%13在湖北省烟草上发现有2种短体线虫，分别是咖啡短体线虫和刻痕短体线虫(P.crenatus)0陈代倩%1&检测到福建省烟草根部有穿刺短体线虫(P.penetrans)和咖啡短体线虫寄生。

但上述研究大多集中在对烟草根际线虫的分离鉴定上，并未对其致病性进行进一步分析。

2018年，笔者在河南省南阳市烟草种植区采集到变褐腐烂的烟株根系，并从中分离到大量短体线虫，本研究拟采用形态学和分子生物学相结合的方法对所采集的短体线虫进行准确鉴定，并利用室内盆栽试验测定其对烟草的致病力，旨在明确河南省南阳市烟草根际短体线虫的种类及其对烟草的致病性，进而为烟草线虫病害的防控提供依据。

1材料与方法
1.1样品采集与线虫分离
在河南省南阳市方城县清河乡的烟草大田，采集了5个变褐腐烂的烟株根系样品。

将采集到的病根剪碎后与根际土壤混匀，采用改良的贝曼漏斗法分离样品中的线虫%14。

1)短体线虫的纯化培养
在体视显微镜下挑取短体线虫雌虫，并将单条雌虫消毒后接种在胡萝卜愈伤组织上，25g黑暗培养大约70d%15，即可得到纯化后的短体线虫种群。

1)短体线虫的形态学鉴定
体视显微镜下挑取短体线虫，置于凹玻片上的无菌水中，在酒精灯火焰上加热杀死，快速将杀死的线虫挑至体积分数4%FG固定液(V(福尔马林"：V(甘油)：V(蒸］水)=10:1:89)中进行固定，将固定好的线虫采用甘油-乙醇脱水法脱水，再采用蜡圈法%14制作永久玻片。

使用装有数码相机(Nikon DS-R12)和NIS-Elements AR专用软件的尼康光学显微镜(Nikon Eclipse Ti-S)对短体线虫玻片标本进行形态观察、特征值测量并拍照。

1)短体线虫的分子鉴定及系统进化树构建
参照王江玲等%16&的蛋白酶K法进行单条线虫DNA提取。

rDNA-ITS区采用通用引物18S(5-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3')和26S(5-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG3')进行PCR扩增%17；rDNA28S D2〜D3区采用通用引物D2A(5-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG3')和D3B (5-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3')进行PCR 扩增%18。

PCR反应体系参照KOD FX DNA聚合酶(Toyob。

，日本)说明书配制。

PCR反应条件为: 94g预变性2min；98g变性10s,5&2g(ITS 区)或51.7g(28S D2〜D3区)退火30s,68g延伸90s,34个循环；72g终延伸10min。

PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(Omega，美国)纯化回收后，连接至PJET1.2/blunt克隆载体(Thermo Sci­entific,美国)，并转入DH5a感受态细胞，37g培养12h,挑取阳性克隆斑于含100mg/mL氨节青霉素的LB液体培养基中，37g、150r/min振荡培养6〜8h,经菌液PCR验证后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

将新获得的序列提交Gen-Bank据(NCBI上的BLAST程进
列相似性分析。

从GenBank数据库下载短体线虫rDNAITS和rDNA28S D2〜D3区序列，利用MEGA中的ClustalW方法进行序列比对分析%19&。

第1期王硕，等：河南烟草根际短体线虫鉴定及其致病性分析
87
采用MrModeltest 2. 3进行最优核昔酸替代模型的选 择。

使用MrBayes 重建短体线虫的系统发育树%0&。

基于rDNA-TS 和rDNA 28S D2〜D3区序列分别 构建进化树，参考已发表的文献%181选择外组。

1. 5短体线虫的致病力测定
将健康饱满的烟草种子种植于装有灭菌土的花 盆(直径24 cm)中，每盆3粒，覆土约1 cm ,出苗7 d
后剔除弱苗，每盆保留长势一致的单株健壮幼苗。

将本研究获得的供试短体线虫种群接种在胡萝卜愈 伤组织上，扩繁培养后制成1 000条/mL 的短体线
虫悬浮液。

烟草种植30 d 后，挑选长势一致的烟草
植株接种短体线虫，每盆接种2 mL,接种量为2 000 条/盆,共接种5盆，设置不接种线虫的烟草作为对
表1
南阳烟草短体线虫和咖啡短体线虫形态测量值的比较
照，接种线虫75 d 后，观察短体线虫危害烟草的症 状，测量烟草株高、地上部鲜质量和根鲜质量，分离
统计烟草根际的线虫数量并计算线虫的繁殖率 (Rf ):Rf =最终分离虫量/起始接种虫量。

1. 6数据处理
采用SPSS 软件进行试验数据分析，对烟草株
高、地上部鲜质量和根鲜质量分别采用独立样本t 检验分析。

2结果与分析
2.1短体线虫的种类鉴定
2.1.1形态特征 南阳烟草短体线虫的形态测量
值见表1)
Table 1
Comparison of morphometries of Pratylenchus population from tobacco in Nanyang and P.
coffeae
咖啡短体线虫％2&
P . coffeae in lterature %2&
南阳烟草短体线虫
Pratylenchus population from tobacco in Nanyang
形态特征
虫 Female
虫 Male 虫 Female 虫 Male
n
20212020
L /%m 580.8士64.1444.0 〜704.5 )504.3士42.4 430.4〜578.7)601.9士51.4(520.0〜715.0)589.1士25.4(558.5〜647.5)
a
28.1士3.0(22.9〜34.7)29.8士2.8(24.6〜34.6)28.7士3.1(23.4〜34.0)30.8士1.6(28.7〜33.9)
b
6.0士0.64.9〜6.9)
5.7士0.3(5.3 〜
6.4) 6.7士0.4(5.6〜
7.2)
6.7士0.3(6.0 〜
7.3)
b 4.7士0.5 (3.9 〜5.8) 4.5士0.4 4.0〜5.4)
—
—
c 19.9士1.7(15.7〜23.5)
20.7士2.0(17.5〜25.4)
20.9士2.8(17.0〜31.0)
21.8士1.6(19.4〜25.4)
! c 1.6士0.2(1.2〜2.0) 2.2士0.3(1.7〜2.6)
—
—V /%
81.8士0.9(80.3—83.0)40.3士4.5(31.9-46.5)
80.5士1.5(76.0〜82.5)
—
>/%—
40.3士4.5(31.9—46.5)
—
DGO/%m 2.6士0.3(2.1〜3.4)
2.5士0.3(2.1〜
3.2)
2.8士0.5(2.5〜4.0)
3.6士0.3(3.0〜
4.0)
'Tail / %m
29.3士2.9(24.4〜33.5)24.8士1.6(22.3〜28.4)
29.0士3.3(21.5〜36.0)
27.1士1.9(24.5〜31.0)
VA/%m 83.5士10.9(64.6〜102.8)—
87.2士12.8(70.5〜135.0)
—St/%m
16.4士0.8(14.9〜17.7)
15.3士0.6(13.8〜16.3)16.9士0.2(16.5〜17.0)
—ML/%m
8.5士0.5(7.5〜9.1)
7.9士0.6(6.7 〜9.0)
——ExP/%m 82.5士7.4(68.8〜93.0)
73.3士4.1(64.4〜81.5)
——AEGL/%m
124.9士12.9(99.3〜152.3)
113.4士13.3(95.6〜148.3)
—
—POL/%m 30.6士9.7(18.4〜51.0)26.0士11.0(17.8〜58.6)
49.8士10.3(34.0〜72.5)
—P-v. SL/%m
24.6士3.9(20.3〜31.8)—
29.5士6.5(19.5〜49.5)
—LFW/%m 7.2士0.9(6.0 〜8.7)
6.0士0.6(5.1〜
7.1 )
——No.TA
27.0士1.8(22.0〜30.0)
—
——SL/%m —17.6士1.0(15.4〜19.9)——GL/%m
—
4.3士0.4(3.8 〜
5.5 )
—
—
注：”•测量标本数量丄•线虫体长'•体长/最大体宽'•体长/体前端至食道与肠连接处的距离体长/体前端至食道腺末端的距离'•
体长/尾长尾长/肛门处体宽;匕体前端至阴门的距离/体长f 100% ；丁.泄殖腔口至精巢前端的距离/体长f 100% ；DGO.背食道 腺幵口至口针基部球的距离尾长；VA.肛门至阴门距离；St. 口针长；ML.针锥部长；ExP.体前端至排泄孔的距离；AEGL.体前
端至食道腺末端的距离；POL.食道腺覆盖肠长度；Pv SL.后阴子宫囊长；LFW.侧区宽；No. TA.尾部体环数;SL.交合刺长；GL.引带
长。

Note :n . Number of specimens measured ； L . Body length ； a . Body length/greatest body width ； b . Body length/length from the lips to the
junction of esophageal gland and intestine ； l . Body length/length from the lips to esophageal gland end'. Body length/ tail length ； c'• Tail length/tail diameter at anus ； V . Distance of vulva from the lips/body lengthf 100% ； >. Distance from cloaca opening to ante ­
rior-most part of testis/body length f 100% ； DGO. Distance between dorsal esophageal gland opening and stylet knobs ； '丁祖.Tail
length 'VA.Di3tancefromvulvatoanu3'St.Styletlength 'ML.Metenchiumlength 'ExP.Lengthfromanteriorendtoexcretorypore '
AEGL.Lengthfromthelip3toe3ophagealglandend 'POL.Pharyngealoverlap 'P-v.SL.Po3t-vulval3aclength 'teralfield
width 'No.TA.No.oftailannuli 'SL.Spiculelength 'GL.Gubernaculumlength.
88西北农林科技大学学报（自然科学版）第49卷
由图1-A〜I可见，南阳烟草短体线虫雌虫热杀死后虫直或略向腹面弯曲。

头架显，唇低平、略微缢缩，有2）具4条侧线。

口粗、强壮，基圆形至椭圆形。

中食卵圆形，食道腺覆盖，覆盖长度宽的1）〜3）倍。

排泄孔位于半月体后，半月体约2个体环宽。

受精显，圆形或椭圆形，内含精子。

尾圆柱形，末端光滑窄圆。

腺口小，位于尾中
由图1J〜L可知，南阳烟草短体钱虫雄虫虫体前端形征与雌虫相似。

交合细，长15.4〜19.9%m，引带长38〜5.5%m，交合伞包至尾端，尾较尖。

从上述结果看，本研究中采集到的短体线虫种群的形态特征与文献匚虫的形[征一致，阳烟草根际采集到的短体虫种群初步鉴定虫。

雌虫(A〜I)：A.雌虫整体，B.雌虫体前部，C〜D.雌虫头部(箭头指示为口针),E.后阴子宫囊，F.受精囊，
G.雌虫侧区侧线，H〜I.雌虫尾部；雄虫(J〜L):J.交合伞，K.交合刺，L.雄虫整体
Females(A—I):A.Entier body,B.Anterior region,C—D.Lip region(the arrow shows stylet),E.Post-vulval sac,
F.Spermatheca,'.Lateral lines,H—I.Tail region；Male(J—L):J.Bursa,K.Spicules,L.Entier body
图1南阳烟草短体线虫的光学显微观察
Fig.1Light micrographs of Pratylenchus population from tobacco in Nanyang
2.1）分子生物学鉴定对河南南阳烟草短体线虫的rDNA-ITS区进行PCR，获得1条长度为1249bp的序列片段（图2）。

在NCBI上进BLAST，显示本研究的虫rD-NAITS区序列（GenBank登录号:MN749379）与GenBank数据库中咖啡短体线虫rDNA-ITS序列的相似性为9
3.97%〜99.84%。

对河南南阳烟草短体线虫的rDNA28S D2〜
D3进，1条度781bp的序列片段（图2）。

在NCBI上进行BLAST分析，显
示本研究中获得的短体线虫rDNA28S D2〜D3区（GenBank登:MN750755），与GenBank 数据库中咖啡短体线虫种群rDNA28S D2〜D3区序列的相似性为96.46%〜100.00%。

第1期
王 硕，等:河南烟草根际短体线虫鉴定及其致病性分析89
M
1
2
2 000 bp
1 000 bp 750 bp
1 249 bp
781 bp
M. DL2000 Marker'. rDNA-ITS 区扩增产物；
2. rDNA 28S D2〜D3区扩增产物
M. DL 2000 Marker '. Amplification of the rDNA-ITS region ；
2. Amplification of the rDNA 28S D2 —D3 region
图2南阳烟草短体线虫rDNA-ITS 和
rDNA 28S D2〜D3区的PCR 扩增
Fig. 2 PCR amplification of the rDNA-ITS and rDNA 28S D2 —D3 region of Pratylenchus population from
tobacco in Nanyang
2. 1. 3系统发育分析 基于河南南阳烟草短体线
虫rDNA-ITS 区和rDNA 28S D2〜D3区序歹U,分
进化树。

结果（图3和图4）显示，本研
究 的 虫 与已报道的 虫序形成高度支持的分支（PP=100）。

进一步实，南阳烟草根际的 虫
虫。

2. 2咖啡短体线虫的危害症状与致病性
发现，与对照组相比，接种
虫
75 d 后，接种组烟草 现为地上部生长缓慢，植
株矮小、长势弱，叶片出现明显黄。

由于 1
虫的侵染
，烟草
的 显 、质
量减轻，出现坏死腐烂症状（图5-A 〜B ）。

在咖啡短
虫侵染初期，烟草
出现褐色或红褐色的侵
染病斑（图5-C ）；随着病情的不断加重，烟草
的
斑不断扩大，出现整条
死腐烂的现象，最终
导致整个根系的大面积坏死腐烂（图5-D 〜E ）。

94
100
100r 朱顶红短体线虫 Pratylenchus hippeastri FJ7129367补朱顶红短体缆虫 Pratylenchus hippeastri KR029085
拟确夢里达麻祜线S Pratylenchusparafloridensis GQ988378
100拟初罗里迭短体线虫 Pratylenchusparafloridensis GQ988377|佛罗里达短体线虫 Pratylenchusfloridensis GQ988375
［也杰尼短体线虫 Pratylenchusjeahni FJ712940八 杰尼短祐线虫 Pratylenchusjeahni FJ712939—阿劳卡起尿壕虫 Pratylenchus araucensis FJ154951 lOO rffr^r 里希纳短体线虫 Pratylenchus scribneri KX842626 7 '嶄克里希纳短体线虫 Pratylenchus scribneri MK208689----殳氏短体线虫 Pratylenchus alleni JX081545100|假血啡起体线虫 Pratylenchuspseudocoffeae KT971367
—假咖啡短体线虫 Pratylenchuspseudocoffeae LC030339
---------古轶雷斯短体线虫 Pratylenchusgutierrezi FJ712931
55「卢斯短体线虫 Pratylenchus loosi HM469439
----- 占嶄起体线虫 Pratylenchus loosi JN091968
1 OS 右厮:起律线虫 Pratylenchus loosi FJ712943
________________100| 白本短体线虫 Pratylenchus j aponic a s KF452048
日本短袜袋虫 Pratylenchus j aponicas KF452049
「南阳烟草短体线^Pratylenchus sp.MN749379 -咖诽短体线虫 Pratylenchus coffeae KR106219 -血啡短林线虫 Pratylenchus coffeae KR106209 -咖啡短命殘虫 Pratylenchus coffeae KR106208 '咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae KR106211 痂曄短律线虫 Pratylenchus coffeae MK256317 -咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae KY424205 "咖昨短体第虫 Pratylenchus coffeae KY424211 -咖啡粗体经虫 Pratylenchus coffeae MH729035 咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae KR106213 ■咖啡短栋娄虫 Pratylenchus coffeae KR106216
-咖啡短体殘虫 Pratylenchus coffeae KY 424210 -血啡短体线虫 Pratylenchus cc 庞ae FJ827744 •咖 啡短体线虫 Pratylenchus coffeae KC 218572 •咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae KC24420598i 古氏痘体线虫 Pratylenchus goodeyi FR692324'---------玉米短体线虫 Pratylenchuszeae JN020935-----巴哈蒂短体线 i Pratylenchus bhattii JN244275
-------拟禾米短体绫虫 Pratylenchusparazeae KP903450
伤残短体线虫 Pratylenchus vulnus FJ713007 ■兵豆短命线虫 Pratylenchus Ze 加s AM933158
---------伪短体线虫 Pratylenchusfallax KY828273
异常珍珠线虫 Nacobbus aberrans DQ318611
100
100
84
10076591009夬视罗里达短Pratylenchus f loridensis GQ988376
1四广」_八小亠「 . . --------------loo p ；
571100 •
超过50%的后验概率显示在相应的分支上，新获得的序列加粗显示。

下图同
Posterior probabilities more than 50% are given for appropriate clades ，
Newly obtained sequence is indicated in bold font. The same below
图3基于rDNA-ITS 序列的南阳烟草短体线虫的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of Pratylenchus population from tobacco in Nanyang inferred from rDNA-ITS
sequences
90西北农林科技大学学报（自然科学版）
第49卷
86
0.05
100
97
98
100
95r 朱顶红短体线虫 Pratylenchus hippeastri KJ00172093P-朱项红短体^^ Pratylenchus hippeastri KR029084 73Jp “ —............TW -拟佛罗里达短体线虫
Pratylenchusparafloridensis GU214114 -拟确罗里达短体线虫 Pratylenchusparafloridensis GU214115
_[•佛罗里达短体线虫 Pratylenchus f loridensis AF 170437
10汛 确罗里达短体线虫 Pratylenchusfloridensis GU214117 —血劳卡短屣躱虫 Pratylenchus araucensis FJ463262
lOOr 鶴咖啡短命线虫 Pratylenchuspseudocoffeae KT175533 | L 假咖啡短体线虫 Pratylenchuspseudocoffeae KT971360L 斯克里布纳短体线虫 Pratylenchus scribneri MK209593
-斯克里布纳短体线虫 Pratylenchus scribneri KX842633 ---艾氏痘体线虫 Pratylenchus alleni MF155653
100—古袂雷嶄短体线虫 Pratylenchusgutierrezi AF 170442
古袂雷斯起体 ^^Pratylenchus gutierrezi KT971357
_____
卢斯短体经虫 Pratylenchus loo s i HM469431 ~ 占琳短体羲虫 Pratylenchus loosi Kf430797 南阳熠草短体线虫Pratylenchus sp.MN750755
咖咋短体线虫 Pratylenchus coffeae HM469433 咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae HM469434
咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae KY424272 咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae KY424273 咖啡短屣线虫 Pratylenchus coffeae KY424274 咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae KY424277 咖啡短栋线虫 Pratylenchus coffeae KY424278 咖啡短栋缕虫 Pratylenchus coffeae KY424279 咖啡短袜线虫 Pratylenchus coffeae KY424281 咖啡短体缕虫 Pratylenchus coffeae MG906751 咖啡短祜线虫 Pratylenchus coffeae MG906754 咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae MH730447
咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae MK256315 血啡短体缕虫 Pratylenchus coffeae MK829009
| 日 本短体线虫 Pratylenchus j aponic a s KF385444 1001 日本短栋线虫 Pratylenchus j aponicas KF385445 ------------玉来麻体线虫 Pratylenchuszeae KT033000
-------------拟至米起麻线虫 Pratylenchusparazeae KP903445 ------德氏短体线虫 Pratylenchus delattrei JX261949 —巴哈蒂短体线虫 Pratylenchus bhattii JN244270
100100
971100]1
ioo TT —100100
64
ioo —
100
|------------西班牙短体线虫 Pratylenchus hispaniensis FJ717822
100-------------2—布热斯基短体线虫 Pratylenchus brzeskii AM231927
--------------落选短体线虫 Pratylenchus neglectus MG205581 索氏短体线虫 Pratylenchus thornei KT213559
---------------------------------长尾東ll 线 虫 Belonolaimus longicaudatus DQ328710
图4基于rDNA 28S D2〜D3序列的南阳烟草短体线虫的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of Pratylenchus population from tobacco in Nanyang inferred from rDNA 28S D2 — D3 sequences
A.健康根系（CK ） ；
B.接种 虫根系；
C.浅棕色或橙褐色小病斑；
D.扩大的病斑；
E.线虫严重侵染根系
A. Root of healthy plant (CK) ；
B. Roots infected by P . coffeae ；
C. Small, light brown or orange-brown spots ；
D. Expanding lesions ;
E. Roots seriously infected by P . coffeae
图5烟草根系受咖啡短体线虫侵染的症状
Fig. 5 Symptoms of tobacco roots infected by P .
coffeae
第1期王硕，等：河南烟草根际短体线虫鉴定及其致病性分析91
由表2可知，接种咖啡短体线虫75 d 后，从烟 草根部和根际土壤中分离得到大量的咖啡短体线
虫，每株烟草根际平均虫量达到(11 613 + 581. 09) 条,繁殖率(Rf )达到5. 81 + 0 29；接种咖啡短体线
虫组烟草的平均株高为5& 54 cm,平均地上部鲜质
表2
Table2 Nematodedensityof P .co --eae recoveredfromtobacco75dafterinoculationandthee f ectsonplantgrowth
接种咖啡短体线虫75 d 后的虫量及其对烟草生长的影响
处理
Treatment
株高/cm
Height 地上部鲜质量/( •盆】)
根鲜质量/(g -盆】)
线虫量/(条-盆】)
繁殖率R f )
Freshweightofthe Freshweight
Numberof
Repoduction
above-groundplant
ofroot
nematodesperplant
r ate
接种组
Inoculatedgroup
58 54 + 3. 37…
49 50 + 4. 13 …20. 58 + 0. 81 …
11 613 + 581. 09
5.81+0.29
CK 75.73+2.09
75.94+1.70
27.72+1.49
0.00.0
注：表中数值为5个重复的“平均值士标准误/，..表示经t 检验不同处理组间差异显著(P V 0.01)。

Note : Values represent mean of five "replicates 士SE", . . indicates significant differences between treatments based on t -test (P <0. 01).
3
植物寄生线虫是烟草的重要病原物之一，据报 道，根结线虫(Jeloidogyne)、短体线虫、球抱囊线虫 (..Globodera)、矮化线虫(..Tylenchorhynchus)等都会 侵染危害烟草，并造成一定的经济损失%1，0,3。

此
外，长针线虫属(Longidorus ) A 拟长针线虫属 (.Paralongidorus)、毛刺线虫属(Trichodorus)、拟 毛刺线虫属(Paratrichodorus)和剑线虫属(Xiphi
n e ma )的一些线虫种类不仅直接危害烟草植株，而
且在取食过程中还会传播某些植物病毒造成更大危 害%10,4&。

短体线虫也叫根腐线虫，国内外均有其寄 生危害烟草的报道。

如在美国北卡罗来纳州和津巴
虫 (P .brach&urus ) 生
害烟草的报道％526&。

在加拿大，穿刺短体线虫是危
害烟草的主要线虫，给烟草生产带来严重的经济损 失，除此之外还有落选短体线虫寄生危害烟草的报 道％627。

另夕卜，在美国田纳西州也有短体线虫 (Pratylenchus spp.)寄生危害烟草的报道％8。

在 国 ，
选
虫、
虫、
体线虫、刻痕短体线虫和穿刺短体线虫等寄生危害 烟草的报道%1'9'1113。

但是国内以往对烟草寄生短 体线虫的研究，有些只是普查数据，或者仅进行了形 态特征分析，大多缺乏详细的分子特征分析，也未见 有关短体线虫对烟草致病性的相关研究报道。

本研 究采用形态学和分子生物学相结合的方法，对采自 河南南阳烟草根际的短体线虫进行鉴定，明确此短
体线虫种群为咖啡短体线虫。

贺哲等％9&报道，从瑞 昌山药上采集到的咖啡短体线虫的ITS 序列与
GenBank 数据库中咖啡短体线虫相应ITS 序列的
相似度为93%〜99%，变异达到7%。

本研究获得
量和根鲜质量分别为49. 50和20. 58 g/盆，显著低 于对照组(CK)烟草(其平均株高为75. 73 cm,地上
部、根的鲜质量分别为75. 94和27. 72 g/盆)(P <
0.01)，表明咖啡短体线虫对烟草具有明显的致病
性。

的咖啡短体线虫ITS 序列(MN749379)与数据库中
虫 ITS 的 相 93;97% 〜
99.84%，变异达到6.03%，在已有文献％9&报道的咖
啡短体线虫种群ITS 的变异范围以内。

杜宇等%7获 的
虫 D2 〜D3 与 GenBank
据
虫 D2 〜 D3
的 相 度
97%〜99%，变异达到3%。

本研究中获得的咖啡
短体线虫D2〜D3区序列(MN750755)与GenBank 数据库中咖啡短体线虫相应序列的相似性为
96. 46%〜100. 00%，变异达到3. 54%，与文献［7］报
道的咖啡短体线虫的种群内变异范围基本相当。

短
体线虫的这种种内差异比较常见，特别是ITS 序列 的种内变异较大，这可能与不同种群所处的地理环
境不同有关％033。

本研究的室内盆栽致病性试验初 步证实，该咖啡短体线虫种群可对烟草根系造成明
显的危害，会导致根系腐烂而影响烟草的健康生长，
虫种 草具 ｛的 ，为河南烟草线虫病害的诊断和防治提供了有效的理 论依据。

河南是我国重要的烟草种植区，而烟草上另外
一种重要病害，即烟草黑胫病在河南的发生也较为 严重［3435］。

有研究指出，当最短尾短体线虫和烟草
黑胫病菌共同存在时，短体线虫侵染造成的伤口能 促进烟草黑胫病菌的侵染，从而加重烟草黑胫病的
发 程度%10&。

， 重要 草种虫的危害状况，及当地短体线虫种群的存在是否会
加重烟草黑胫病的发生，均还有待进一步的调查和
研究。

4
在河南南阳烟草种植区烟草植株根际发现了一
92西北农林科技大学学报（自然科学版）第49卷
种短体线虫，根据线虫的形态特征和rDNA-TS、rDNA28S D2〜D3区序列特征分析及构建的系统发育进化树，确定该短体线虫为咖啡短体线虫。

经室内盆栽接种试验确定，该线虫能够侵染危害烟草根系，造成烟草根系腐烂坏死，烟叶黄化萎蔦，对烟草具有明显的致病性。

[参考文献]
%1&陈代倩.烟草线虫病害及病原线虫种类的鉴定:D&.福州：福建农林大学，2013.
Chen D Q.Identification of parasitic nematodes species and to­bacco nematode diseases[D&.Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University2013.
：2：李芳芳.河南省烟叶生产SWOT分析及发展策略[J&.安徽农业科学，2017,45(8):237-239,242.
LiF F;SWOT analysisanddevelopmentstrategy oftobacco production in Henan province[J&.Journal of Anhui Agricul­tural Sciences,2017,45(8)：237-239,242.
：3：刘园，李倩，吴疆，等.烟叶生产标准化对南阳烟叶供给侧结构性改革的作用□：•安徽农业科学,2018,46(13):219-221;
Liu Y，LiQ，WuJ，etal;E f ectsofstandardizationonsupply-side structural reforms of Nanyang tobacco[J&.Journal of An­hui Agricultural Sciences,2018,46(13):219-221.
[4&Janssen T，Karssen G，Orlando V，et al.Molecular characteriza-tionandspe=iesdelimitingofplant-parasiti=nematodesofthe genus Pratylenchus from the Penetrans group(Nematoda：Pra-tylenchidae)[J&.Molecular Phylogenetics and Evolution，2017117:30-48.
：5：刘海璐，王暄，李红梅，等•我国黄淮麦区10个短体线虫样品种类的分子鉴定:J&.中国农业科学2018,51(15):2898-2912.
Liu H L(Wang X(Li H M(etal.Molecularidentification of Pratylenchus species in10samples collected from wheat field
in Huanghuai region of China[J&.Scientia Agricutura Sinica，2018，51(15):2898-2912;
[6&Qing X,Bert W,Gamliel A,et al.Phylogeography and molecu­lar species delimitation of Pratylenchus capsici n.sp.,a new root-lesion nematode in Israel on pepper(Capsicum annuum) [J&.Phytopathology,2019,109(5):847-85&
杜宇，邓宗汉，丁元明，等.四种短体线虫的形态和分子生物学鉴定:J&.植物病理学报2020,50(1):28-39.
DuY(DengZ H(Ding Y M etal;Morphologicalidentification and molecularcharacteristicsand phylogeneticrelationship of
four root-lesion nematodes(Nematoda：Pratylenchidae)[J&.
ActaPhytopathologicaSinica，2020，50(1)28-39;
：8：高士仁，丁兆龙，李中华•山东省烟草根际线虫调查与研究初报:J&.山东农业大学学报，1989,20(4)7980.
GaoSR，DingZ L，LiZ H Investigationandstudyonrhizo-sphere nematodes of tobacco in Shandong province[J&.Journal ofShandongAgriculturalUniversity，1989，204)79-80.
：9：刘学敏，刘淑艳，高洁，等.吉林省烟草根腐线虫病初步研究
:J&.青岛农业大学学报(自然科学版)，2004,21()：109110.
LiuX M，LiuSY，GaoJ，etal;Studiesontobaccolesionnema-
tode disease in Jilin province[J&.Journal of Qingdao Agricul-
turalUniversity(NaturalScienceEditi'n)，2004，21(2)109­
110.
[10&Johnson C S,Way J,Barker K R.Nematode parasites of tobac­co[M&//Luc M,Sikora R A,Bridge J.Plant parasitic nema-
#CA-
BI Publishing,005:675-708.
%11&刘修勇，刘维志.山东省短体科Pratylenchidae植物寄生线虫名录•青岛农业大学学报(自然科学版),007,4(2)=175-
176;
Liu X Y,Liu W Z.Species of nematodes of Pratylenchidae in
Shandong province[J&.Journal of Qingdao Agricultural Uni­
versity(Natural Science Edition)，2007，24(2)175-176.
%12&焦永吉.河南省烟草寄生线虫复合病害及其防治:D&.郑州：河南农业大学，2014.
JiaoYJ;Tobaccoparasiticnematodecomplexecologicalcon-
trol in Henan province[D&.Zhengzhou:Henan Agricultural
University2014;
：13：李建立，赵洪海,李锡宏，等.湖北省烟草上植物线虫种类鉴定:J&.湖北农业科学，2012,51(21)：4795-4798.
LiJL(Zhao H H(LiX H etalIdentificationofplantnema-
tode species on tobacco in Hubei province[J&.Hubei Agricul-
turalSciences201251(21):4795-4798;
%14&谢辉.植物线虫分类学:M&2版.北京：高等教育出版, 2005;
Xie H.Taxonomy of plant nematodes[M&.2nd ed.Beijing：
HigherEducationPress2005;
%15&陈晓玲，李小妮，张永瑜，等.咖啡短体线虫人工繁殖方法研究:J&.广东农业科学2008(11):58-60.
ChenX L(LiX N(ZhangY Y etal;Studyon methoddogyof
monoxenically reproduction of Pratylenchus coffea[J&.
GuangdongAgriculturalSciences，2008(11):58-60;
：16：王江玲，张建成,顾建锋.单条线虫DNA提取方法:J&.植物，2011，25(2):32-35;
WangJL，ZhangJC，GuJF;MethodofextractDNAfroma
single nematode[J&.Plant Quarantine,2011,25(2):32-35. [17]Vrain T C,Wakarchuk D A,Levesque A C,et al.Intraspecific
rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xi~
phinema americanum group[J&.Fundamental and Applied
Nematology,1992,15(6):563-573;
[18]Subbotin S A,Ragsdale E J,Mullens T,et al.A phylogenetic
framework for root-lesion nematodes of the genus Pratylen-
chus(Nematoda):evidencefrom18S and D2-D3expansion
segmentsof28S ribosomal RNA genes and morphological
characters[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2008,
48(2)491-505;
[19]TamuraK(Peterson D(Peterson N etal;MEGA5:molecular
evolutionarygeneticsanalysisusingmaximumlikelihood evo-
lutionarydistance(and maximum parsimony methods[J];
Molecular Biology and Evolution201128(10):2731-2739;
第1期王硕，等：河南烟草根际短体线虫鉴定及其致病性分析93
[20&Huelsenbeck J P,Ronquist F.Mrbayes：bayesian inference of phylogenetic trees[J&.Bioinformatics,2001,17(8)：754-755.
Wang H H,Zhuo K,Ye W M,et al.Morphological and molec­
ular charaterisation of Pratylenchus parazeae n.sp.(Nema-
toda:Pratylenchidae)parasitizing sugarcane in China[J&.Eu-
ropeanJournalofPlantPathology2015143(1)173-191; [22]Inserra R N,Duncan L W,Troccoii A,et al.Pratylenchus jae-
hni sp;n;from citrus in Brazil and its relationship with P.
coffeae and P.loosi(Nematoda:Pratylenchidae)[J&.Nema­
tology20013(7)：653-665;
%3&陈瑞泰.世界烟草病害形势中国烟草科学，1989,9!)：5-
11.
Chen R T.World tobacco disease stuation[J&.Chinese To-
baccoScience19899(3)：5-11;
李芳荣，龙海，谢泳桂，等.38种我国进境植物检疫性传毒
线虫简介中国植保导刊，2015,35(5):6871.
Li F R,Long H,Xie Y G,et al.Introduction to38species of
imp'rtedplantquarantinetransmi t edvirusnemat'desinChi-
na China Plant Protection,2015,35(5):68-71.
[25]Johnson A W,Nusbaum C J.Interactions between Meloido-
gyneincognita,J.hapla,and Pratylenchusbrachyurus in
Tobacco Journal of Nematology,1970,2(4) :334-340.
[26&Rich J R,Arnett J D,Shepherd J A,et al.Chemical control of nematodes on flue-cured tobacco in Brazil ,Canada ,United
Statesand Zimbabwe[J&.Journal of Nematology,1989,21
4S):609-611.
Tu C M,Marks C F,Elliot J M.Effects of nematicides on
Pratylenchus penetranss'ilnitrificati'n andgr'wth'fflue-
cured tobacco[J&.Bulletin of Environmental Contamination
andToxicology199657(6):924-931;
[28]Koenning S R,Overstreet C,Noling J W,et al.Survey of crop
lossesinresponsetophytoparasiticnematodesinthe United
States for1994%].Journal of Nematology,1999,31(4S):
587-618.
%9]贺哲,黄婷,李俊科,等.瑞昌山药根腐线虫病病原鉴定:J].江西农业大学学报，2016,38(5):879-883.
HeZ HuangT LiJK etalIdentificationofnematodecau-
sing yam root rot in Ruichang Cty,Jiangxi province[J].Ac­
ta Agriculturae UniversitisJiangxiensis201638(5):879-
883;
%0]陈晓玲,陈永红,张洪玲,等.咖啡短体线虫分子鉴定%]•植 物200923(2):7-9;
ChenXL Chen Y H Zhang H L etal;Molecularidentifica-
tion for Pratylenchus coffeae[J].Plant Quarantine,2009,23
(2):7-9.
：31]王金成,魏亚东,顾建锋,等.基于核糖体ITS区和28S rRNA D2〜D3区的短体线虫系统发育研究:J].动物分类学报,
2012374):687-693;
WangJC WeiY D GuJ F etal;Phylogeneticanalysisof
Pratylenchus(Nematode:Pratylenchidae)basedonribosomal
i-nternal transcribed spacers(ITS)and D2—D3expansion
segmen/sof28SrRNAgene[J].Ac/aZoo/axonomicaSinica
2012374):687-693.
%2]王宏洪，黄少彬,杨晓朱,等.地稔根际根腐线虫的形态和分子鉴定:J].热带作物学报，2018,39(9)：1820-1826.
Wang H H HuangS B Yang X Z etal;Morphologicaland
molecular identification of a species of root lesion nematode
parasitizing Jelastomadodecandrum[J];ChineseJournalof
TropicalCrops201839(9)1820-1826;
%3]王宏洪，卓侃,薛会英,等.西藏自治区色季拉山高寒草甸牧
草根腐线虫的鉴定％]•华中农业大学学报,2019,38(1):59-
66;
Wang H H ZhuoK XueH Y etalIdentificationofrootrot
nematode of herbage in alpine meadow of Sejira mountain, Ti-
betautonomousregion[J].JournalofHuazhongAgricultural
University201938(1):59-66.
%4]崔林幵,赵珊珊，高鹏飞,等.河南省烟草黑胫病菌群体遗传结构的SSR分析:J].中国烟草学报，2018,24(5):51-56.
CuiL K ZhaoSS GaoPF etal;SSRanalysisofpopulation
geneticstructureoftobacoo blackshankin Henan province
[J];ActaTabacariaSinica201824(5):51-56;
%5]王正浩,王维超,毋彦彬,等.烟草黑胫病绿色防控技术研究进展:J].安徽农业科学2019,47(10):18-21,24.
WangZ H Wang WC WuYB etal;Progressintheresearch
ofgreencontroltechnologyoftobaccoblackshank[J]Jour-
nalofAnhuiAgriculturalSciences201947(10)18-2124;。