非酒精性脂肪肝脂联素SNP+45、SNP+276与脂联素水平以及相关指标的相关关系

非酒精性脂肪肝脂联素SNP+45、SNP+276与脂联素水平
以及相关指标的相关关系
龚丽青;李莉;赵效国;张永红;江艳;顾亚静;周晶
【摘要】目的探讨非酒精性脂肪肝脂联素基因SNP+45、SNP+276单核苷酸多
态性与非酒精性脂肪肝(NAFLD)相关指标以及血清脂联素(APN)水平的相关关系.
方法从2011年新疆克拉玛依地区非酒精性脂肪肝流行病学调查中随机选出符合NAFLD纳入标准的NAFLD组255例,健康对照组405例.采用聚合酶链限制性片
段长度多态(PCR-RFLP)方法鉴定APN基因SNP+45、SNP+276核苷酸多态性.
结果SNP45G、SNP276G位点的Age、BMI、WHR、SBP、DBP、FBG、AST、TG、CHO、APN、SUA偏高,HDL偏低.SNP45G携带者NAFLD患病率高于TT
携带者(41.1%>36.9%),差异无统计学意义(P>0.05); SNP276T突变基因携带者NAFLD患病率低于GG携带者(32.8%< 43.5%),差异具有统计学意义
(P<0.05).NAFLD组和对照组人群中SNP+45 多态性位点分布为:TT型50.4%和55.3%,GT型 43.1和41.5%,GG型 6.7%和3.2%;SNP+276 多态性位点分布为:TT 型 9.8%和12.6%,GT型29.4%和37.8%,GG型 60.8%和49.6%.两组SNP+45多态性位点基因型频率及等位基因频率的分布差异无统计学意义(P>0.05);NAFLD组SNP+276出现突变基因型的频率明显低于对照组,差异均有统计学意义
(P<0.05).Logistic回归分析显示,APN276T等位基因、血清脂联素水平是NAFLD 发病的独立保护因素;Age、WC、BMI是NAFLD 发病的独立危险因素,而
APN45T>G 基因多态性与非酒精性脂肪性肝病的发病无相关关系(P＞0.05).结论APN+276G/T多态性与NAFLD的发生有关,APN276T突变等位基因是NAFLD
的独立保护因素;未发现APN+45 多态性与NAFLD的发病有关.APN+45、+276
多态性影响血清脂联素的表达,携带非突变的45T与突变的276T等位基因的个体
血清脂联素水平高.
【期刊名称】《新疆医科大学学报》
【年(卷),期】2013(036)006
【总页数】6页(P860-864,868)
【关键词】非酒精性脂肪肝;脂联素;基因多态性
【作者】龚丽青;李莉;赵效国;张永红;江艳;顾亚静;周晶
【作者单位】新疆医科大学公共卫生学院,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附
属医院营养科,乌鲁木齐,830054;新疆医科大学公共卫生学院,乌鲁木齐,830011;克
拉玛依市中心医院体检中心,新疆,克拉玛依,834000;新疆医科大学第一附属医院营
养科,乌鲁木齐,830054;新疆医科大学第一附属医院营养科,乌鲁木齐,830054;新疆
医科大学第一附属医院营养科,乌鲁木齐,830054
【正文语种】中文
【中图分类】R575
近年来，随着人们生活方式和饮食结构的改变，非酒精性脂肪肝的患病率不断上升，已经成为了肝脏疾病的主要表现形式［1］。

目前认为脂质代谢紊乱与胰岛素抵抗所引发的高游离脂肪酸、高胰岛素血症是非酒精性脂肪肝（NAFLD）发病机制的
中心环节［2］。

以往研究表明，脂联素可增加胰岛素敏感性，降低血脂，保护肝脏；脂联素水平降低与胰岛素抵抗、血脂异常、肝脏对活性氧和细胞因子损害的敏感性增加以及肝内炎症、坏死的发生等密切相关［3－4］。

因此，为了预防
NAFLD，对脂联素进行进一步地研究非常重要。

本研究主要探讨脂联素基因位点
多态性与脂联素水平和非酒精性脂肪肝相关指标的关系。

1 资料与方法
1.1 研究对象所有研究对象均为2011年4月新疆克拉玛依市社区体检中心的体检者，参照中华医学会肝脏病学分会制定的诊断标准［5］，凡具备下列（1）～（5）和（6）或（7）项中任一项者，可诊断为NAFLD：（1）无饮酒史或饮酒折含乙
醇量小于140g／w（女性＜70g／w）；（2）除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定疾病；（3）除原发病的临床表现外，可有乏力、消化不良、肝区隐痛、肝脾肿大等非特异性征象；（4）可有体质量超重／内脏性肥胖、空腹血糖增高、血脂紊乱、高血压等代谢综合征相关组分；（5）血清转氨酶和γ－谷酰基转移酶水平可有轻至中度增高（小于5倍正常值上限），通常以丙氨酸转氨酶（ALT）增高为主；（6）肝脏影像学表现符合弥漫性
脂肪肝的影像学诊断标准；（7）肝活检组织学改变符合脂肪性肝病的病理学诊断标准。

排除病毒性肝炎、专业临床医师进行B超检查结果无肝胆系统疾病。

随机
选出汉族NAFLD患者255例，平均年龄（44.67±9.46）岁；同时选择健康对照
人群405例，平均年龄（39.92±9.02）岁。

1.2 方法
1.2.1 基本资料由培训合格的调查人员对身高、体重、腰围、血压等基本参数进行
测定。

计算体质指数（BMI）＝体质量（kg）／身高2（m2）。

禁食12h后清晨空腹肘静脉采血2mL，采用日立7600全自动生化检测仪测定各项血液生化指标，包括空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、门冬氨酸转氨酶（AST）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、血尿酸（SUA）、脂联素（APN）等指标。

1.2.2 外周血白细胞DNA 的提取依据全式金生物技术有限公司全血DNA 提取方
法提取基因组，－20℃长期保存。

1.2.3 脂联素基因SNP＋45、SNP＋276多态性检测采用聚合酶链反应–限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）技术检测脂联素SNP＋45、SNP＋276多态性。

PCR 引物由上海生物工程设计，＋45上下游引物分别为：5′－GGACGGAGTCCTTTGTAGGTC－3′、5′－AAGACCAACCCCAA ATCACTT－3′；反应条件为预变性95 ℃预变性5min，94 ℃变性30s，54 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，共循环35次，最后72 ℃延伸10 min。

2%琼脂糖电泳鉴定PCR 产物。

用限制性内切酶SmaⅠ进行酶切PCR产物，30℃水浴16h消化后，行3%琼脂糖凝胶电泳，得到该SNP 的基因分型结果。

SNP＋276 上、下游引物分别为：5′－GGAATAGGGATGAGGGTGAAG－3′、5′－AAGGGTGAGAAAGGAGATCCA－3′，在PCR 仪中反应条件为：94 ℃预变性4min，94 ℃变性30s，49℃退火30s，72 ℃延伸30s，共循环35次，最后72℃延伸5min。

取5μL PCR 产物，用限制性内切酶Bs mⅠ进行酶切PCR 产物，37℃水浴16h消化。

行3%琼脂糖凝胶电泳，即得到该SNP的基因分型结果。

1.3 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析，基因及等位基因频率分布的
比较采用χ2 检验，计量资料间比较采用t检验。

NAFLD 的危险因素用多因素Logistic回归分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 PCR 扩增结果两组人群的APN＋45位点及276位点基因型频率实际值与期
望值比较差异无统计学意义（P ＞0.05），说明APN 基因上述位点基因型频率均符合Hardy－Weinberg 遗传平衡定律，具有群体代表性。

2.1.1 SNP＋45 位点酶切结果 SNP＋45位点经Sma Ⅰ酶切后产生3 种基因型，
分别为野生型（TT）、杂合子型（TG）、纯合子突变型（GG）。

野生型（TT）
显示2根条带（135bp 和324bp），杂合子型（TG）显示3根条带（459、135
和324bp），纯合子突变型（GG）显示1根条带（459bp），见图1。

2.1.2 SNP＋276位点酶切结果 SNP＋276位点经Bsm Ⅰ酶切后产生3 种基因型，分别为：野生型（GG）、杂合子型（TG）、纯合子突变型（TT）。

野生型（GG）显示2 根条带（198bp 和83bp），杂合子型（TG）显示3根条带（281、198
和83bp），纯合子突变型（TT）显示1根条带（281bp），见图2。

图1 脂联素基因SNP＋45的PCR－RFLP电泳图
图2 脂联素基因SNP＋276 电泳结果
2.2 SNP＋45、SNP＋276野生型和突变型临床生物化学指标的比较
2.2.1 SNP＋45野生型和突变型临床生物化学指标的比较因为基因位点的突变，
携带G 位点（TG＋GG）受试对象（302 例）Age、BMI、WHR、DBP、SBP、FBG、AST、TG、CHO、APN、SUA 等指标相比野生型TT 基因型携带者（358例）偏高，HDL 偏低，其中WHR、SUA、APN 的差异具有统计学意义（P ＜
0.05）。

突变基因G 携带者NAFLD患病率要高于野生型TT基因型携带者（41.1%＞36.9%）（P＞0.05），差异无统计学意义，见表1。

表1 SNP＋45突变基因TG／GG对各个生化指标的影响（±s）注：与TT 相比，＊P ＜0.05。

TG＋GG TT Age／岁项目42.41±9.68 41.21±10.34 BMI／（kg／
m2）26.79±11.72 25.75±10.71 WHR 0.88±0.11＊0.85±0.09 SBP／mmHg 119.6±18.03 117.6±16.52 DBP／mmHg 79.4±11.7 77.7±10.9 FBG／（mmol ／L）5.90±1.24 5.82±1.05 TG／（mmol／L）1.78±1.22 1.71±1.06 CHO／（mmol／L）5.23±1.01 5.30±1.00 HDL／（mmol／L）1.79±0.34 1.81±0.35 LDL／（mmol／L）2.69±1.12 2.82±1.41 APN／（μg／mL）13.03±1.29＊14.54±1.44 SUA（mmol／L）278.5±65.8＊266.3±70.6 NAFLD／例（%）124（41.1）132（36.9）
2.2.2 SNP＋276野生型和突变型临床生物化学指标的比较 SNP＋276突变基因T
携带者（GT＋TT，304 例）Age、BMI、WHR、SBP、DBP、FBG、AST、TG、CHO、APN和SUA 相比野生型GG 基因携带者（356 例）偏低，HDL 偏高，其中Age、BMI、WHR、SBP、DBP、SUA、HDL 和APN 的差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

突变基因T 携带者NAFLD的患病率比野生型GG 的低（32.8%＜43.5%），差异具有统计学意义（P ＜0.05），见表2。

表2 SNP276突变基因GT／TT对各个生化指标的影响（±s）注：与GG 相比，＊P ＜0.05。

GT＋TT GG Age／岁40.54±9.18＊项目42.81±10.65 BMI／（kg ／m2）24.9±11.39＊27.35±10.91 WHR 0.83±0.11＊0.88±0.07 SBP／mmHg 114.3±15.9＊122.2±17.5 DBP／mmHg 76.0±10.86＊8.7±11.3 FBG／（mmol ／L）5.77±0.82 5.94±1.36 TG／（mmol／L）1.66±1.26 1.8±1.1 CHO／（mmol／L）5.22±0.94 3.31±1.05 HDL／（mmol／L）1.83±0.36＊
1.77±0.33 LDL／（mmol／L）
2.76±1.48 2.75±1.29 APN／（μg／mL）14.9±1.09＊12.95±1.33 SUA（mmol／L）261.6±64.9＊280.5±70.7 NAFLD／例（%）100（32.8%）＊155（4
3.5%）
2.3 NAFLD病例组和对照组SNP＋45、SNP＋276基因型频率和等位基因频率比较 APN＋45多态性位点3种基因型在NAFLD 组与对照组中的分布为：TT 型50.4% 与55.3%，GT 型4
3.1% 与41.5%，GG 型6.7%与3.2%；APN＋45多态性位点2种等位基因频率在NAFLD 与对照组中的分布为：T 71.8%与76.1%，G 28.2%与23.9%。

两组基因＋45多态性位点基因型频率及等位基因频率的分布差异无统计学意义（P ＞0.05），见表3。

APN ＋276 多态性位点3种基因型在NAFLD 组／对照组中的分布为：TT 型9.8%与12.6%，GT 型29.4%与37.8%，GG 型60.8%与49.6%，NAFLD组出现突变基因型的频率明显低于对照组，差异均有统计学意义（P ＜0.05），见表4。

表3 NAFLD组和对照组SNP45基因频率比较／例（%）组别 TT 基因型 TG 基因
型 GG 基因型 T 等位基因 G 等位基因NAFLD 128（50.4） 110（43.1）17（6.7）366（71.8） 144（28.2）对照组 224（55.3） 168（41.5）13（3.2）616（76.1） 194（23.9）
表4 NAFLD组和对照组SNP276基因频率比较／例（%）注：与对照组比较，＊P ＜0.05。

组别GG 基因型 GT 基因型 TT 基因型 G 等位基因 T 等位基因NAFLD 155（60.8）＊ 75（29.4）＊ 25（9.8）＊ 385（75.5）＊ 125（24.5）＊对照
组201（49.6） 153（37.8） 51（12.6） 555（68.5） 255（31.5）
2.4 NFALD 影响因素的Logistic回归分析在所研究对象中，以是否患脂肪肝为应变量，以WHR、BMI、SBP、DBP、TC、HDL、LDL、TG、AST、FBG、APN 水平和ADP＋45、＋276基因多态性作为自变量进行Logstic回归分析，结果显示APN276T 等位基因、血清脂联素水平NAFLD 患病的独立保护因素；Age、WHR、BMI是NAFLD 发病的独立危险因素，而APN＋45基因多态性与非酒精性脂肪性肝病的患病无相关性（P ＞0.05），见表5。

表5 NAFLD影响因素的Logistic回归分析结果因素βWaldχ2 OR95%CI P APN 0.433 21.846 0.648（0.541～0.778）＜0.001 276GT＋TT 0.453 7.797 0.623（0.421～0.867）0.005 Age 0.023 3.923 1.02（1～1.05）0.048 BMI 0.143 10.363 1.154（1.058～1.259）0.001 WHR 0.067 12.286 1.069（1.03～1.11）＜0.001
3 讨论
人类脂联素基因位于染色体3q27，全长约17kb，包括3个外显子和2个内含子。

人类脂联素基因存在多种单核苷酸（SNP）多态性，其基因变异可能会影响脂联
素的表达，进而导致脂联素血浆水平的变化［6］。

目前针对脂联素的研究大量集中于肥胖、2 型糖尿病以及代谢综合征［7］，陈晓
毓等［8］针对福建省汉族人群的研究结果显示SNP45G 等位基因与脂联素水平
的降低、胰岛素水平降低、肥胖以及血脂密切相关；Du 等［9］的研究结果也显
示携带SNP45G突变等位基因人群，血浆脂联素水平较TT 基因型的低，同时增
加了患2型糖尿病的风险；这些研究表明SNP45位点多态性与代谢综合征密切相关。

2型糖尿病和NAFLD 作为代谢综合征的重要组成部分，推测该位点基因多态性增加NAFLD 易感性。

目前已经明确低脂联素水平与NAFLD 患病有关，但是对脂联素基因多态性与NAFLD 患病易感性的研究结果仍不统一。

本研究结果显示SNP45突变基因G 携带者体内脂联素水平明显低于野生型TT基因型携带者，差
异具有统计学意义（P ＜0.05），但是突变基因G 携带者NAFLD 患病率与野生
基因T 携带者之间的差异无统计学意义（P ＞0.05）。

黄春明等［10］针对广州
人群脂联素基因多态性与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）遗传易感性的关系研究
结果也显示，SNP45多态性与NAFLD 发病无相关性。

Wang等［11］对武汉NAFLD 合并MS汉族人群研究结果显示SNP45多态性与NAFLD、MS、脂肪肝
变性程度均无差异，与本研究结果一致。

不一致结果的是日本Tokushige等［12］通过肝活检发现NAFLD合并严重纤维化组SNP45突变基因型GG显著高于轻度
肝纤维组，IR 在GG 基因型中显著升高，表明SNP45多态性与NAFLD 发病以及发展紧密相关。

Kang等［13］对韩国DM 患者SNP276研究结果表明GG 型较
其他基因型空腹血糖水平及糖化血红蛋白水平高，并且血清脂联素水平较其他基因型稍低。

Qi等［14］的研究也发现，在美国男性DM患者中，脂联素基因
G276T 多态性提高了血清脂联素水平，并且降低了并发心血管疾病的危险性，结
果与本研究结果相同，本的研究发现SNP276突变基因T 携带者血清脂联素水平
高与GG 基因型，并且TT 基因型携带者NAFLD 的患病率明显比野生型GG 携带者的低，差异具有统计学意义（P ＜0.05），通过Logistic回归发现SNP276位
点TT 基因型是NAFLD 患病的保护因素（OR：0.623）。

与之不同的是Musso
等［15］研究发现脂联素SNP276多态性与NAFLD 的发病密切相关，并与肝脏
炎症及纤维化程度相关。

石胜利等［16］和张宗胜等［17］对脂联素多态性对NAFLD 的影响结果也显示SNP276T 增加了患NAFLD 的风险。

目前这种不同人种、不同地区间的研究结果不一致的原因尚不明确，但这也印证了在不同人种、地区中，脂肪细胞因子基因的变异与蛋白浓度以及胰岛素抵抗关系不同［16］，这些不一致的研究结论也可能受研究方法、研究的样本含量影响，未来尚需更大样本含量的研究来进一步检验这些研究结果。

本研究中，脂联素SNP45、SNP276多态性除了对脂联素水平有影响外，还发现对Age、BMI、WHR、SBP、DBP、FBG、AST、TG、CHO、APN、SUA 与HDL的水平也有影响。

本研究发现SNP45T／G，携带G 位点受试对象的Age、BMI、WHR、SBP、DBP、FBG、AST、TG、CHO、APN、SUA 相比野生型TT 基因型携带者偏高，HDL偏低；其中WHR、SUA、APN 的差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

SNP276突变基因T 携带者体内的Age、BMI、WHR、SBP、DBP、FBG、AST、TG、CHO、APN、SUA 相比野生型GG 基因携带者偏低，HDL 偏高，其中Age、BMI、WHR、SBP、DBP、SUA、HDL、APN 的差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

Age、BMI、WHR、SBP、DBP、FBG、AST、TG、CHO、APN、SUA 等指标都与代谢综合征、糖尿病、肥胖等慢性疾病紧密相关，提示SNP45T／G、SNP276G／T 多态性与代谢综合征、糖尿病、肥胖具有相关性，表明SNP276多态性对糖脂代谢中的双重作用，更加能够影响人类的健康。

测定血清脂联素浓度以及多态性可以预测非酒精性脂肪性肝病发生的风险度，识别高危人群，对非酒精性脂肪性肝病的治疗可能会有较好的作用。

但是，脂联素基因多态性SNP45 和SNP276 在NAFLD 中的研究结果在不同的国家、不同的种族及相同的国家不同的地区仍有争议，有待于进一步研究。

【相关文献】
［1］Caballería L，Auladell MA，Torán P，et al.Prevalence and factors associated with the presence of non alcoholic fatty liver disease in an apparently healthy adult population in primary care units［J］.BMC Gastroenterol，2007，7：41.
［2］ Kotronen A，Juurinen L，Tiikkainen M，et al.Increased liver fat，impaired insulin clearance，and hepatic and adipose tissue insulin resistance in type 2 diabetes
［J］.Gastroenterology，2008，135（1）：122－130.
［3］ Musso G，Gambino R，Biroli G，et al.Hypoadiponectinemia predicts the severity of hepatic fibrosis and pancreatic Beta－cell dysfunction in nondiabetic nonobese patients with nonalcoholic steatohepatitis［J］.Am J Gastroenterol，2005，100（11）：2438－2446.
［4］ Bianchi G，Bugianesi E，Frystyk J，et al.Adiponectin isoforms，insulin resistance and liver histology in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Dig Liver Dis，2011，43（1）：73－77.
［5］中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2010，6：483－487.
［6］ Kadowaki T，Yamauchi T，Kubotan M，et al.Adiponectin and adiponectin receptorsin insuiin resistance，diabetes，and the metaboiicsyndrome［J］.Clin Invest，2006，116（7）：1784－1792.
［7］王延焦，焦宜，陈红，等.维，汉两名族脂联素基因＋45位点和349位点SNPs及其肥胖关系的研究［J］.新疆医科大学学报，2010，33（6）：609－611.
［8］陈晓毓，李希圣，林夏鸿，等.肥胖患者脂联素基因第45位点单核苷酸多态性与血浆脂联素水平及胰岛素抵抗的相关性研究［J］.国际放射医学核医学杂志，2012，36（5）：269－274. ［9］ Du W，Li Q，Lu Y，et al.Genetic variants in ADIPOQ gene and the risk of type
2diabetes：a case－control study of Chinese Han population［J］.Endocrine，2011，40（3）：413－422.
［10］黄春明，李瑜元，周永健，等.脂联素基因多态性与非酒精性脂肪肝发病易感性的关系［J］.广东医学，2010，20（2）：1－5.
［11］ Wang ZL，Xia B，Shrestha U.Correlation between adiponectin polymorphisms and non－alcoholic fatty liver disease with or without metabolic syndrome in Chinese population［J］.J Endocrinol Invest，2008，31（12）：1086－1091.
［12］ Tokushige K，Hashimoto E，Noto H，et al.Influence of adiponectin gene polymorphisms in Japanese patients with nonalcoholic fatty liver disease［J］.J Gastroenterol，2009，44（9）：976－982.
［13］ Kang ES，Park SY，Kim HJ，et al.The influence of adiponectin gene polymorphism on the rosiglitazone response in patients with type 2diabetes［J］.Diabetes Care，2005，
28（5）：1139－1144.
［14］ Qi L，Li T，Rimm E，et al.The＋276polymorphism of the APM1gene，plasma adiponectin concentration，and cardiovascular risk in diabetic men［J］.Diabete，2005，54（5）：1607－1610.
［15］ Musso G，Gambino R，De Michieli F，et al.Adiponectin gene polymorphisms modulate acute adiponectin response to dietary fat：Possible pathogenetic role in NASH ［J］.Hepatology，2008，47（4）：1167－1177.
［16］石胜利，聂玉强，李瑜元，等.脂联素基因多态性和血清脂联素水平与非酒精性脂肪性肝病的相关性［J］.世界华人消化杂志，2012，20（21）：1982－1986.
［17］张宗胜，周永健，李瑜元，等.脂联素基因标签单核甘酸多态性与非酒精性脂肪肝病的相关性［J］.广东医学，2012，33（21）：3225－3232.。