基因的时间开关——CreERT系统

基因的时间开关——CreERT系统
基因的时间开关
为了研究某个基因的作用，或者其他目的（如标记特定时段的印记神经元），科学家需要在某一特定时间打开或关闭某个基因的表达。

这就需要一个灵敏基因开关。

常用的开关有两个，其一是基于四环素的TetTag系统，四环素的存在可启动或阻止位于四环素操纵子后的基因表达。

（请看：基因的时间开关——TetTag系统）
而另一个常见的基因开关是CreERT系统。

CreERT由三个关键字Cre、ER、T组合而成，分别对应于CreERT系统中的三个关键物质：Cre重组酶、雌激素受体（ER，estrogen receptor）和药物他莫昔芬（T，Tamoxifen）。

CreERT系统可被药物他莫昔芬诱导开启。

我们一一来拆解CreERT名字里的关键因素。

Cre-Loxp重组酶系统
Cre是一种识别特异位点的基因重组酶，Cre酶的基因序列来源于P1噬菌体的环化重组酶（c yclization re combinase），Cre的名字也源于此。

Cre酶可识别一段名为Loxp的特定基因序列。

Loxp序列长34个碱基，包括中间8碱基的不对称序列，以及两侧反向回文的13碱基序列。

Loxp序列由不对称的中间8bp和回文对称的两侧13bp组成，N 碱基表示该位置可以是任何碱基
中间的8碱基决定了Loxp序列的方向，而Loxp序列的方向决定了Cre酶的剪切方式。

通常，Loxp序列会成对出现。

如果两个Loxp的方向相同，那么，当Cre酶结合两个Loxp位点后，会删除两个Loxp之间的基因序列，以及一个Loxp序列。

如果两个Loxp序列方向相同，则Cre重组酶删除两个loxp之间的基因序列
利用这一特性，科学家设计了一个基因开关。

在目标基因（如下图中的绿色荧光蛋白GFP）之前，构建一段包含两个同向的Loxp的基因序列，两个Loxp之间是一个阻止基因转录的STOP序列。

由于STOP序列的存在，绿色荧光蛋白是无法被转录翻译的。

当Cre酶出现时，Cre酶会切除同向Loxp之间的STOP序列。

之后，绿色荧光蛋白便会顺利表达。

这一过程是可逆的。

Cre酶切除同向Loxp之间的STOP序列，使GFP能够转录翻译如果两个Loxp序列方向相反，Cre重组酶则会将两个Loxp之间的基因序列反转、左右颠倒。

如果两个Loxp序列方向相反，则Cre重组酶会使两个loxp之间的基因序列反转
但这种Cre酶的重组反应也是处于动态平衡中的，因为反转后两个loxp仍然是反向的，Cre酶可以接着将之反转回去。

为了克服Cre酶重组过程可逆的弱点，科学家设计了另外一种常用的基因开关序列，DIO序列（double-floxed inverted open reading frame）。

DIO序列中包含两种类型的Cre酶识别位点，一种是Loxp，野生型的。

另一种是基因突变后的Loxp，如Lox2722。

Cre酶的重组反应只发生在同种Loxp位点之间，即只重组两个Loxp之间的基因序列，或只重组两个Lox2722之间的基因序列。

重组不会在一个Loxp和Lox2722之间发生。

两个Loxp和两个Lox2722的方向都相反，并间隔分布（如下图）。

两种loxp之间的序列是目标基因，目标基因的序列是反向的，无法表达出有意义的蛋白质。

当Cre酶出现时，Cre酶的连续重组作用最终会将反向目标基因变为正向，之后目标基因便可正常表达。

Cre酶的重组过程分为两步。

第一步是反转。

在Cre酶作用下，两个方向相反的LoxP之间的序列，会被反转。

反转可能发生在两个LoxP之间，也可能发生在两个
Lox2722之间。

这两个反转无论谁发生，都不会影响最后结果。

这一步的重组反应是可逆回去的。

第一步，Loxp对之间或Lox2272对之间基因的反转，过程可逆
反转发生后，下一步是Cre酶引发的重组删除。

LoxP引发的反转会让两个原本反向的Lox2722变为同向，反之亦然。

同向的两个LoxP 或Lox2722位点会引发Cre酶的剪切功能。

Cre酶会剪切掉一个Lox2722和一个LoxP。

最后剩下的一个LoxP和Lox2722之间不会再发生Cre酶的重组，也不会再逆反回去。

它是稳定的状态。

第二步，Cre酶将基因片段剪切成稳定状态，这一反应过程不可逆以上两种方法是常用的依赖于Cre酶的基因开启方式。

但要想实现特定时间的基因启动，科学家还需借助其他基因工具。

这一工具是雌激素受体。

雌激素受体ER和Cre酶的融合，实现了目标基因的定时开启雌激素受体（ER，estrogen receptor）是雌酮、雌二醇等女性荷尔蒙的细胞内蛋白受体，分为核雌激素受体和膜雌激素受体。

雌激素受体蛋白结构
在没有雌激素的情况下，核雌激素受体跟热休克蛋白90（HSP90，heat shock protein 90）结合在一起。

由于热休克蛋白的阻挡，雌激素受体无法进入细胞核，只能游荡于细胞质内。

雌激素出现后，雌激素会跟核雌激素受体结合，并将热休克蛋白90从雌激素受体上排挤走。

热休克蛋白90消失后，雌激素受体便可大摇大摆进入细胞核，调控位于核内的基因的表达。

雌激素受体跟雌激素结合后，可进入细胞核调控基因表达
科学家通过基因编辑，将雌激素受体的配体结合域和Cre酶融合在一起。

这样一来，没有雌激素时，Cre酶、雌激素受体配体结合域和热休克蛋白绑定在一起，在细胞质内飘散。

Cre酶无法进入细胞核启动目标基因表达。

当雌激素出现时，热休克蛋白被排挤掉，Cre酶和雌激素受体的结合体蛋白便可进入细胞核，Cre酶也就可以发挥作用。

他莫昔芬（Tamoxifen）的出现可使Cre酶进入细胞核，调控基因表达。

ER：雌激素受体。

Hsp90：热休克蛋白90
科学家为了排除内源雌激素的影响，突变了雌激素受体。

突变后的雌激素受体不再结合体内的雌激素，只对他莫昔芬这种外源药物有亲和力。

也就是说，只有当他莫昔芬出现时，Cre酶才能入核调控基因表达。

同时，由于与Cre酶融合的只是雌激素受体的配体结合域，因此不会触发雌激素受体相应的基因调控。

总结
当科学家需要开启Cre酶介导的目标基因表达时，只需将外源药物他莫昔芬可通过口服或注射进入动物体内即可。

CreERT系统实现了基因表达的时间控制，在时间要求精准的科学研究中大放异彩。

例如，在记忆的研究中，CreERT系统（或TetTag 系统），和即刻早期基因一起，经常作为基因表达的时间开关，特异地标记出只参与某一段记忆的神经元。