竹节参总皂苷通过NF—κB 通路对LPS致RAW264.7细胞炎症的保护作用研究

竹节参总皂苷通过NF—κB 通路对LPS致RAW264.7细胞炎症的保
护作用研究
目的：探讨竹节参总皂苷对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用。

方法：噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度的竹节参总皂苷对RAW264.7细胞活性的影响；一氧化氮（NO）试剂盒法检测竹节参总皂苷对LPS刺激RAW264.7细胞的NO释放量；酶联免疫吸附法（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素1-β（IL-1β）分泌；逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS），TNF-α，IL-1β mRNA的表达；免疫印迹法（Western blot）检测胞核内核转录因子-κB p65（NF-κB p65）蛋白表达。

结果：竹节参总皂苷的安全用药范围为≤80 mg·L-1；与LPS模型组相比，竹节参总皂苷各剂量组（0.1，1，10，40 mg·L-1）均能显著降低LPS刺激下RAW264.7细胞NO，TNF-α和IL-1β分泌；竹节参总皂苷各剂量组（10，40 mg·L-1）均能抑制iNOS，TNF-α，IL-1β mRNA表达和NF-κB p65蛋白表达。

结论：初步证实了竹节参总皂苷对LPS 致RAW264.7巨噬细胞炎症的保护作用，作用机制可能与NF-κB通路有关。

标签：竹节参总皂苷；小鼠巨噬细胞系；脂多糖；抗炎
1 材料
1.1 药物提取配制竹节参的块根是在湖北恩施椿木营竹节参种植基地采集，由湖北省天然产物研究与开发重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C. A. Mey。

竹节参总皂苷（total saponins of P. japonicus，TPSJ）是由本研究团队提取分离，其提取分离方法参照前期研究基础[4]，提取率为18.4%，纯度83.48%[5]。

实验前用PBS溶解配成质量浓度为1 000 mg·L-1的母液，再用培养基稀释至所需质量浓度。

1.2 试剂DMEM高糖培养基（Gbico，884684）；胎牛血清（杭州四季清公司，100607）；LPS B5：O55（Sigma公司，110M4086V）；Trizol，DEPC，PCR 扩增试剂盒（上海生工生物工程有限公司，A7107-1，SJ0312B4013J和12091564F）；PrimeScriPt RT reagent Kit With gDNA Eraser（大连宝生物工程有限公司，BK401）；一氧化氮检测试剂盒（碧云天生物公司，S0021-3）；TNF-α，IL-lβ ELISA试剂盒（上海欣博盛生物科技有限公司，M121015-12a和M121029-07a）；NF-κB抗体（Cell Signaling Technology，L8F6）；MTT（武漢博士德生物公司，AR1156）；ECL试剂盒（武汉科瑞生物有限公司，P1010）；BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，P1511）；β-actin，iNOS，TNF-α，IL-1β引物由上海生工合成，引物序列如下：β-actin上游5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3′，下游5′-TGGATGCCACAGGATTCCAT-3′；iNOS上游5′-GCCCTGCTTTGTGCGAAG-3′，下游5′-GCCCTTTGTGCTGGGAGTC-3′；TNF-α上游5′-AGGCAACCTGACCACTCTCC-3′，下游5′-CACCACCATCAAGGACTCAA-3′；IL-1β上游
5′-TGTCCTGTGTAATGAAAGACGGC-3′，下游5′-GCTTGTGCTGCTTGTGAGG-3′。

1.3 仪器NU-4750E 型二氧化碳培养箱（Nu Aire公司）；CKX41倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；TD25-WS多管架自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）；SW-4T-2F洁净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；CT15RT 高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备工程有限公司）；Thermo全波长酶标仪（芬兰，TECAN INPINIFETMF 200）；9902型PCR扩增仪（新加坡AB Applied Biosystems）；Gene Genius凝胶分析系统（英国SYNGNE公司）；165-1801型PCR 及Western电泳仪（美国Bio-Rad）。

2 方法
2.1 细胞培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞（中国科学院上海细胞库）用含10%胎牛血清的DMEM培养基，放置在37 ℃，5%CO2培养箱中培养，取对数期细胞用于实验。

2.2 细胞活力检测RAW264.7细胞悬液接种96孔板，细胞数为1×104个/mL，每孔100 μL，设置调零孔、正常组（细胞+培养基）、竹节参总皂苷组，给药质量浓度为5，10，20，40，80，100，200 mg·L-1，每组4个复孔，24 h后吸取上清液，在每孔中加入终浓度为0.5 mg·L-1MTT的培养基100 μL，继续培养4 h，然后将上清去掉，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速震荡10 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度A。

2.3 一氧化氮（NO）检测和细胞因子检测RAW264.7细胞悬液接种24孔板，细胞数为1×105个/mL，每孔1 mL，同时加入不同浓度的竹节参总皂苷（质量浓度为0.1，1，10，40 mg·L-1）和1 mg·L-1 LPS[2]作用细胞，设为调零孔、正常组、LPS组、LPS+竹节参总皂苷组，每组4个复孔，24 h后用NO试剂盒检测上清NO释放量。

2.4 细胞因子检测RAW264.7细胞悬液接种24孔板，细胞数为1×105个/mL，每孔1 mL，同时加入不同浓度的竹节参总皂苷（质量浓度为0.1，1，10，40 mg·L-1）和1 mg·L-1 LPS共同作用细胞，设为调零孔、正常组、LPS组、LPS+竹节参总皂苷组，每组4个复孔，24 h后用ELISA试剂盒检测上清TNF-α和IL-1β分泌情况。

2.5 逆转录聚合酶链反应RAW264.7细胞悬液接种6孔板，细胞数为5×105个/mL，每孔2 mL，先加入不同浓度的竹节参总皂苷（质量浓度为10，40 mg·L-1）作用细胞12 h，设为调零孔、正常组、LPS组、LPS+竹节参总皂苷组，再加入1 mg·L-1LPS共同刺激，12 h后，按Trizol试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，然后扩增为cDNA。

TNF-α的扩增条件是94 ℃ 5 min，94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，GOTO2，34个循环，72 ℃5 min；IL-1β和iNOS的扩增条件是94 ℃5 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，GOTO2，34个循环，72 ℃5 min；内参β-actin的扩增条件是94 ℃5 min，94 ℃30 s，58 ℃40 s，72 ℃10 s，
GOTO2，34个循环，72 ℃5 min，琼脂糖凝胶电泳检测mRNA表达情况。

2.6 免疫印迹法检测NF-κB蛋白表达RAW264.7细胞悬液接种6孔板，细胞数为5×105个/mL，每孔2 mL，先加入不同浓度的竹节参总皂苷（质量浓度为10，40 mg·L-1）作用细胞20 h，设为调零孔、正常组、LPS组、LPS+竹节参总皂苷组，再加入1 mg·L-1LPS共同刺激，4 h后，根据试剂盒提取胞核蛋白，检测细胞胞核内NF-κB p65蛋白表达情况，采用BCA蛋白定量法检测各组细胞胞核浓度，95 ℃灭活蛋白5～10 min，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，ECL显色，显影定影至柯达胶片。

2.7 统计分析炎性因子释放数据采用GraphPad Prism 5软件分析，PCR与Western数据采用Image J软件分析，数据以±s表示，组间采用单因素方差（One-Way ANOV A）分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果
3.1 竹节参总皂苷对RAW26
4.7细胞形态影响在100倍镜下，可以看到正常细胞，细胞贴壁生長，细胞呈圆形；当竹节参总皂苷达到100 mg·L-1时，细胞膜模糊，细胞呈空泡状，但细胞数量并无明显变化；当竹节参总皂苷达到200 mg·L-1时，细胞已经看不到细胞膜，细胞明显破碎，数量减少，见图1。

3.2 竹节参总皂苷对RAW26
4.7细胞活力的影响用MTT法检测细胞经竹节参总皂苷处理后活力。

结果显示，100 mg·L-1时细胞活力有所下降但并无统计学差异，当竹节参总皂苷为200 mg·L-1时，与正常组相比，细胞活力明显下降（P ＜0.01），这与形态学观察结果相符，见图2。

3.3 竹节参总皂苷干预LPS刺激RAW26
4.7后细胞形态的影响在100倍镜下观察，正常组细胞小而圆；当受到LPS刺激后细胞膨胀，且部分呈现梭形；给予竹节参总皂苷干预后，各组细胞形态变圆，趋于正常形态，见图3。

3.4 竹节参总皂苷对LPS致细胞NO，TNF-α和IL-1β表达量影响与正常组相比，LPS组处理后，NO，TNF-α和IL-1β释放量显著升高（P＜0.01），与LPS 组相比，竹节参各组均能显著抑制NO，TNF-α和IL-1β释放量（P＜0.05或P＜0.01），见图4。

3.5 PCR检测细胞iNOS，TNF-α，IL-1β mRNA表达与正常组相比，模型组的iNOS，TNF-α和IL-1β mRNA均显著升高（P＜0.01），竹节参总皂苷用药组降低模型组的iNOS，TNF-α和IL-1β mRNA表达这与ELISA的实验结果相符，见图5。

3.6 Western blot检测细胞胞核NF-κB p65蛋白表达与正常组相比，模型组胞核内NF-κB p65蛋白表达显著升高（P＜0.01），与模型组相比，竹节参总皂苷用药组能显著抑制NF-κB p65表达（P＜0.05），见图6。

4 讨论
炎症是伴随多种疾病状态的一种共有的病理现像，巨噬细胞是主要的炎性细胞，研究发现，当巨噬细胞受到外界抗原刺激时（如LPS）会释放一氧化氮（NO）、白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等重要的炎症细胞因子，它们均可促进炎症反应和组织损伤。

竹节参及其活性成分具有抗炎等多种药理活性。

本实验采用不同剂量的竹节参总皂苷刺激RAW264.7细胞，发现当细胞浓度在80 mg·L-1以内对细胞无明显影响，提示其安全用药范围≤80 mg·L-1。

NO是一种简单却不稳定的自由基，参与多种生理和病理过程。

在体内NO 是由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸（L-Arg）产生。

iNOS主要是在炎症和免疫刺激下表达，进而催化NO持续生成，过量的NO则会促进炎症性疾病的发生和发展。

本实验用不同剂量竹节参总皂苷（0.1，1，10，40 mg·L-1）干预后发现，竹节参总皂苷各剂量组均能有效抑制LPS组NO的释放，抑制率分别为12.4%，26.5%，35.8%，45.9%，具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。

TNF-α和IL-1β由单核-巨噬细胞系统和内皮细胞分泌产生的一种重要的前炎细胞因子，是机体早期炎症的标志物，主要生物学特性是介导炎症反应。

本实验采用ELISA 法检测LPS和竹节参总皂苷共同干预24 h后上清液中TNF-α和IL-1β分泌，得竹节参各剂量组（0.1，1，10，40 mg·L-1）均能显著抑制TNF-α和IL-1β释放，且具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。

然后又运用PCR法检测各组细胞iNOS，TNF-α和IL-1β mRNA表达，发现竹节参总皂苷各剂量组（10，40 mg·L-1）均能显著抑制iNOS，TNF-α和IL-1β mRNA表达（P＜0.05或P＜0.01）。

NF-κB 是早期核转录因子，参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都受NF-κB的调控，在静息状态下，NF-κB和IκB形成复合体存在于胞浆中。

当受到刺激后，IκB激酶复合体（IκB kinase，IKK）活化将IκB磷酸化，使NF-κB与IκB解离，游离的NF-κB迅速移位到细胞核，诱导相关基因转录。

本实验采用Western blot检测胞核NF-κB p65蛋白表达，结果显示，当RAW264.7细胞受到LPS刺激后，胞核内NF-κB p65表达升高，说明NF-κB被激活并发生了核移位，而竹节参总皂苷各剂量组（10，40 mg·L-1）均能抑制NF-κB p65蛋白的表达（P ＜0.05或P＜0.01），抑制核移位，提示竹节参总皂苷可能是通过NF-κB通路发挥抗炎保护作用的。

综上所述，竹节参总皂苷对LPS刺激的RAW264.7细胞炎症具有一定的保护作用，其保护机制可能与竹节参总皂苷能够调控NF-κB通路，进而抑制NO 的释放、降低iNOS，TNF-α和IL-1β表达有关。

[参考文献]
[1] 闵静，景玉萍，刘慧明，等. 竹节参总皂苷对类风湿性关节炎大鼠的抗炎作用及其机制研究[J]. 咸宁学院学报，2011，25 （4）：280.
[2] 敖明章. 竹节参皂苷抗炎抗风湿作用及机理研究[D]. 武汉：华中科技大学：2012.
[3] 袁丁，姚琦，张长城. 竹节参总皂苷对佐剂关节炎大鼠血清TNF-α和IL-1β表达的影响[J]. 山东医药，2009，49（19）：4.
[4] He H B，Xu J，Xu Y Q，et al. Cardio protective effects of saponins from Panax japonicus on acute myocardial ischemia against oxidative stress-triggered damage and cardiac cell death in rats[J]. J Ethnopharmacol，2012，140（1）：73.
[5] 贺海波，徐媛青，魏娜，等. 竹节参总皂苷对H2O2致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（17）：187.
Study on protective effect of total saponins of Panax japonicus on
LPS-induced RAW264.7 cell inflammation through NF-κB pathway
DAI Yan-wen，YUAN Ding，WAN Jing-zhi，ZHANG Chang-cheng，LIU Chao-qi，WANG Ting
（1.Medical College of China Three Gorge University，Yichang 443002，China；
2. Chemistry and Life Science College of China Three Gorges University，Yichang 443002，China）
[Abstract] Objective：To observe the anti-inflammatory effect of total saponins of Panax japonicus on LPS-induced RAW264.7 macrophages. Method：The effect of total saponins of P. japonicus of different concentrations on RAW264.7 cell viability was determined with the MTT method. The NO kit assay was adopted to detect the NO release of total saponins of P. japonicus to LPS-induced RAW264.7 cells. The enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）was used to detect the secretion of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin 1-β （IL-1β）. The reverse transeriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR）was used to determine the expression of inducible nitric oxide synthase （iNOS），TNF-α，IL-1β. The protein expression of nuclear transcription factor-κB p65 （NF-κB p65）was tested by Western blot. Result：The safe medication range of total saponins of P. japonicus was less than 80 mg·L-1. Compared with the LPS model group，total saponins of P. japonicus high，middle and low dose groups （0.1，1，10，40 mg·L-1）could significantly reduce the secretion of NO，TNF-α，IL-1β of LPS-induced RAW264.7 cells，and inhibit the expressions of iNOS，TNF-α and IL-1β mRNA and the protein expression of NF-κB p65. Conclusion：This study preliminarily proves the protective effect of total saponins of P. japonicus on LPS-induced RAW264.7 macrophages. Its action mechanism may be related to NF-κB signal pathway.
[Key words] total saponins of Panax japonicus；mice macrophage system；LPS；anti-inflammation
doi：10.4268/cjcmm20141126。