沙棘HrTCP转录因子家族鉴定及其干旱胁迫下的表达分析

西北植物学报,2021,41(4):0576-0584
A c t a
B o t .B o r e a l .-O c c i d e n t .S i n
.
d o i :10.7606/j .i s s n .1000-4025.2021.04.0576 h t t p ://x b z w x b .a l l j
o u r n a l .n e t 收稿日期:2020-12-24;修改稿收到日期:2021-02-20
基金项目:河北省自然科学基金(C 2020201001);2021年河北大学研究生创新项目(H B U 2021s s 046
)作者简介:姚 莹(1996-),女,在读硕士研究生,主要从事植物分子育种研究㊂E -m a i l :354900576@q q
.c o m *通信作者:刘建凤,博士,副教授,硕士生导师,主要从事植物分子育种研究㊂E -m a i l :j i a n f e n g
l i u @h b u .e d u .c n 沙棘H r T C P 转录因子家族鉴定及其
干旱胁迫下的表达分析
姚 莹1,王 伟2,孙永媛2,曹金锋2,魏建荣1,刘建凤1*
(1河北大学生命科学学院,生命科学与绿色发展研究院,河北保定071002;2沧州市农林科学院,
河北省农作物耐盐碱评价与遗传改良重点实验室,河北沧州061001
)摘 要:T C P 家族是植物特有的响应高盐㊁干旱等非生物胁迫的重要转录因子㊂该研究基于沙棘转录组数据,利用生物信息学与q R T -P C R 对H r T C P 转录因子家族进行鉴定,预测其家族成员的结构和功能,为解析T C P 转录因子调控沙棘抵御干旱胁迫的作用机制奠定基础㊂结果表明:(1)获得了11个H r T C P 转录因子成员,
并命名为H r T C P 2/4/7/8/11/13/15/17/18/19/20,编码氨基酸序列长度在218~590之间,蛋白质相对分子量为23.44~
61.78k D ;亚细胞定位预测发现,除H r T C P 13/17/18蛋白定位于细胞质,其余8个蛋白均定位于细胞核㊂(2)在干旱(15%P E G -6000)和高盐(200mm o l /L N a C l )胁迫后H r T C P 4/7/19/20基因表达量呈不同程度上升趋势,
其中H r T C P 20表达量极显著高于对照,分别是对照的24倍与23倍㊂(3)外源激素脱落酸(0.1mm o l /L A B A )
和茉莉酸甲酯(0.1mm o l /L M e J A )处理后,H r T C P 7/19/20基因表达量也均呈上升趋势,其中,A B A 诱导下H r T C P 19基因表达量达到最高,是对照的16倍,而M e J A 诱导下H r T C P 20基因表达量上升最高,是对照的5倍㊂研究发现,H r T C P s 转录因子家族成员可受干旱㊁高盐和激素诱导表达,进而调控沙棘对干旱胁迫的响应㊂关键词:沙棘;H r T C P 转录因子家族;干旱胁迫;茉莉酸甲酯(M e J A );脱落酸(A B A )
中图分类号:Q 785;Q 786
文献标志码:A
I d e n t i f i c a t i o n o f H r T C P T r a n s c r i p
t i o n F a c t o r s i n S e a b u c k t h o r n (H i p p o p h a e r h a m n o i d e s )a n d I t s R e s p o n s e t o D r o u g
h t S t r e s s Y A O Y i n g 1
,WA N G W e i 2
,S U N Y o n g y u a n 2
,C A O J i n f e n g 2
,W E I J i a n r o n g 1
,L I U J i a n f e n g
1*
(1C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e ,I n s t i t u t e o f L i f e S c i e n c e a n d G r e e n D e v e l o p m e n t ,H e b e i U n i v e r s i t y ,B a o d i n g
,H e b e i 071002,C h i n a ;2H e b e i K e y L a b o r a t o r y o f C r o p S a l t -a l k a l i S t r e s s T o l e r a n c e E v a l u a t i o n a n d G e n e t i c I m p r o v e m e n t ,C a n g z h o u A c a d e m y o
f A
g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y S c i e n c e s ,C a n g
z h o u ,H e b e i 061001,C h i n a )A b s t r a c t :T C P p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n a b i o t i c s t r e s s s u c h a s h i g h s a l t a n d d r o u g
h t .T h e p u t a t i v e H r T C P w e r e e x p l o r e d a n d i d e n t i f i e d f r o m s e a b u c k t h o r n t r a n s c r i p t o m e d a t a a n d a n a l y z e t h e i r s t r u c t u r e a n d b i o i n -f o r m a t i o n .T h e k e y g e n e s i n v o l v e d i n a b i o t i c s t r e s s w e r e o b t a i n e d b y h o m o l o g o u s s e q u e n c e a l i g
n m e n t a n d q R T -P C R.,w e f u r t h e r a n a l y z e d t h e g e n e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f i t s c o r r e s p o n d i n g t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r s o f s e a b u c k t h o r n u n d e r a b i o t i c s t r e s s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t :(1)11p u t a t i v e s e a b u c k t h o r n H r T C P s
w e r e c o n f i r m e d a n d n a m e d H r T C P 2/4/7/8/11/13/15/17/18/19/20.T h e n u m b e r o f a m i n o a c i d s e n c o d e d
b y 11H r T C P s w a s 218-590,t h e r e l a t i v e m o l e
c u l a r w e i g
h t o f t h e p r o t e i n s w a s 23.44-61.78k D ,t h e i s o -
e l e c t r i c p o i n t r a n g e o
f t h e p r o t e i n s w a s6.09-9.72,a n d t h e s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n s w a s i n t h e n u c l e u s e x c e p t f o r t h e s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f H r T C P13/17/18.(2)q R T-P C R s h o w e d t h a t t h e
g e n e s o f H r T C P c a n r e s p o n s e t o a b i o t i c s t r e s s,b u t t
h e r e s p o n s e d e g r e e o f d
i f f e r e n t m e m b e r s i s d i f f e r e n t u n d e r s t r e s s t r e a t m e n t s.T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f H r T C P4/7/19/20i n15%P E G-6000a n d200mm o l/L N a C l w e r e s i g n i f i c a n t l y u p-r e g u l a t e d a n d a m o n g w h i c h t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f H r T C P20w a s t h e m o s t s i g-n i f i c a n t l y h i g h e r c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l,w h i c h w a s24a n d23t i m e s o f t h e c o n t r o l.(3)A f t e r t h e A B A
(0.1mm o l/L)a n d M e J A(0.1mm o l/L)t r e a t m e n t s,H r T C P7/19/20g e n e s a l s o s h o w e d a n u p-r e g u l a t e d
e x p r e s s i o n t r e n d,e s p e c i a l l y t h e e x p r e s s i o n l e v e l o
f H r T C P19w a s m o s t s i
g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d u n d e r t
h e A B A t r e a t m e n t,w h
i c h w a s16t i m e s o f t h e c o n t r o l.T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f H r T C P20w a s m o s t s i g n i f i-c a n t l y u p-r e g u l a t e d i n r e s p o n s e t o M e J A t r e a t m e n t,w h i c h w a s5t i m e s o f t h e c o n t r o l.O u r p r e s e n t s t u d y i n d i c a t e d t h a t t h e m e m b e r s o f t h e H r T C P t r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y c a n b e e x p r e s s e d b y d r o u g h t,s a l t, a n d h o r m o n e s t o r e s p o n s e d r o u g h t s t r e s s o f s e a b u c k t h o r n.
K e y w o r d s:H i p p o p h a e r h a m n o i d e s;H r T C P t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s f a m i l y;d r o u g h t s t r e s s;m e t h y l j a s-m o n a t e;a b s c i s i c a c i d
沙棘(H i p p o p h a e r h a m n o i d e s L.)是胡颓子科㊁沙棘属落叶性灌木或小乔木,其具有耐旱㊁抗风沙㊁适应性强的特性,可在盐碱化或各种恶劣环境下生长良好[1-2],其根系可有效降低水土流失㊁改善土壤理化性质[3-4]㊂此外,沙棘果实㊁茎和叶等各器官均含有丰富的营养物质和活性物质,尤其果实中含有大量的维生素C,被称为 维生素C之王 [5-6]㊂因此,沙棘已发展为中国重要的经济兼生态型树种,被广泛应用于黄土高原植被造林中㊂目前诸多学者致力于沙棘果实营养价值的开发和利用,但对沙棘自身的抗旱特性研究较少,尤其是响应干旱胁迫的分子机制更是鲜见报道㊂
T C P蛋白是植物特有转录因子家族之一,参与植物的生长发育与逆境响应的调节过程,其家族成员已在不同物种中被陆续鉴定与验证㊂T C P基因家族成员均含有一个由59个残基组成的碱性螺旋-环-螺旋(b-H L H)保守T C P结构域[7]㊂在植物进化过程中该基因家族被分为两类T C P,Ⅰ类(G N C-C C)成员也被称为P C F亚家族,而Ⅱ类成员被进一步细分为C I N和C Y C/T B1亚家族[8-9]㊂现已从番茄(S o l a n u m l y c o p e r s i c u m)㊁西瓜(C i t r u l l u s l a n a-t u s)和油菜(B r a s s i c a n a p u s)中分别分离到30㊁27和39个T C P转录因子[10-12]㊂在不同棉花品种中的T C P转录因子家族也随基因组测序的完成相继被鉴定并表达[13]㊂近年来发现T C P转录因子除了在植物发育过程中对细胞增殖和侧生器官发挥作用外[14-15],它们还能通过激素信号传导等过程参与逆境胁迫应答㊂如过表达O s T C P19后可调节A B I4介导的途径提高水稻(O r y z a s a t i v a)抵御干旱胁迫的能力[16];在草莓(F r a g a r i a v e s c a)中发现,F v T C P s基因家族成员受脱落酸诱导并在干旱胁迫下差异表达[17];基于大豆(G l y c i n e m a x)干旱胁迫处理下鉴定的差异表达基因,共鉴定了147个转录因子,其中发现大豆中G m T C P4转录因子通过调节脱落酸和乙烯等植物激素信号,来提高大豆对干旱胁迫的响应能力[18];此外,在干旱条件下,玉米(Z e a m a y s)不同组织中发现有46个Z m T C P基因均参与了玉米植株对干旱胁迫的响应,其中Z m T C P42过表达导致种子萌发时对A B A产生超敏反应,增强了玉米植株抗旱性[19]㊂由此可见, T C P转录因子基因家族在介导植物抵御非生物胁迫中发挥着重要作用㊂
综上,本研究基于实验室前期沙棘转录组数据(P R J N A507906)[20],获得沙棘H r T C P转录因子基因家族序列,利用生物信息学分析方法对沙棘H r T C P转录因子家族成员进行鉴定,并进一步通过q R T-P C R技术分析了关键转录因子成员在干旱㊁高盐胁迫及激素诱导下的表达情况,为明确沙棘H r T C P转录因子介导激素信号通路参与抗旱的作用机制奠定基础㊂
1材料和方法
1.1沙棘植株
实验材料为2~3年生沙棘扦插苗,种植于河北大学实验基地㊂该沙棘原始母株是由蒙古沙棘的实生无性系乌兰格木(H i p p o p h a e r h a m n o i d e s s u b-s p.m o n g o l i c a,母本)与中国沙棘(H i p p o p h a e r h-a m n o i d e s L.s u b s p.s i n e n s i s,父本)杂交获得的F2代无性系,取自于内蒙古磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心(40ʎ25.935'N,106ʎ43.442'E)㊂
775
4期姚莹,等:沙棘H r T C P转录因子家族鉴定及其干旱胁迫下的表达分析
1.2方法
1.2.1沙棘H r T C P转录因子成员预测从N C B I
(h t t p://w w w.n c b i.n l m.n i h.g a v/)分别获得拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)㊁枣(Z i z i p h u s j u j u b a)和水稻(O r y z a s a t i v a)各12个T C P转录因子氨基酸序列㊂从沙棘转录组数据获得22个T C P转录因子序列,利用S MA R T在线软件对T C P蛋白进行功能结构的预测,去除重复序列和不含T C P保守结构域的蛋白,以枣的T C P成员作为参考对照获得含有完整开放阅读框的11个沙棘T C P转录因子家族成员,命名为H r T C P2/4/7/8/11/13/15/17/18/19/20㊂利用E x P A S y P r o t e o m i c s S e r v e r(h t t p://e x p a s y. o r g/)预测所有沙棘H r T C P蛋白的分子量和等电点㊂1.2.2沙棘H r T C P家族的生物信息学利用M E G A6.0软件,通过M u s c l e进行序列比对,对上述沙棘11条H r T C P s的氨基酸序列,采用邻接法(n e i g h b o r-j o i n i n g,N J)及默认参数,校验参数B o o t s t r a p重复500次,构建系统进化树㊂利用P l a-n t T F D B e d u.c n/)进行同源比对㊂利用D N AMA N 软件对沙棘H r T C P蛋白进行序列比对㊂在G S-D S2.0在线软件上(h t t p://g s d s.c b i.p k u.e d u.
c n/)对沙棘T C P转录因子家族进行基因结构分析㊂用M E M E(h t t p://m e m e.n b c z.n e t/m e m e/)分析沙棘T C P蛋白的保守基序㊂
1.2.3沙棘H r T C P转录因子家族基因的表达分析选取生长一致的沙棘扦插植株(株高为1.2~1.5 m),进行以下处理:200mm o l/L N a C l溶液和15% P E G-6000溶液分别均匀喷施在枝条上,于处理后0㊁1㊁12和48h取样;0.1mm o l/L M e J A溶液和0.1mm o l/L A B A溶液分别均匀喷施在枝条上,于处理后0㊁1㊁6和12h取样㊂以上处理均取植株地上部10㊁70和140c m处叶片3片混合取样,3次独立重复,液氮冷冻后-80ħ保存㊂
利用宝生物工程(大连)有限公司的植物总R N A提取试剂盒R N A i s o K i t(D326S)提取沙棘叶片的总R N A,并采用U E I r i s I I R T-P C R s y s t e m f o r F i r s t-S t r a n d c D N A S y n t h e s i s(w i t h d s D N a s e)试剂盒(R2028,U S E v e r b r i g h t I n c.),以总R N A为模板反转录合成c D N A㊂以沙棘泛素基因(H r U b i)为内参基因,使用荧光定量P C R试剂盒(2ˑF a s t S u p e r E v a G r e e n q P C R M a s t e r M i x)进行H r T C P s的基因表达量分析,引物序列信息见表1㊂q R T-P C R反应程序为:95ħ预变性5m i n;94ħ20s,50ħ30s, 72ħ45s,35个循环,95ң65ħ熔解曲线(0.1ħ/s)㊂采用2-ΔΔC t法进行数据分析㊂
2结果与分析
2.1沙棘H r T C P s转录因子家族成员序列特征分析
基于沙棘T C P基因家族转录组数据,得到22条沙棘H r T C P转录本信息(表2),进一步对转录本序列筛选获得含有完整O R F框的T C P序列,并以枣的T C P基因家族成员信息为参考,最终获得11条沙棘H r T C P转录因子家族序列(表3)㊂
通过分析发现该家族的11个成员氨基酸序列长度介于218~590之间,编码蛋白质的相对分子量介于23.44~61.78k D之间,其中分子量最大的是H r T C P8,最小的是H r T C P11㊂蛋白质的等电点范围为6.09~9.72,其中最大为H r T C P7,最小为H r T C P19㊂此外,对蛋白质的亚细胞定位进行预测,结果表明除了H r T C P13/17/18的定位于细胞质,其余8条均在细胞核(表3)㊂
2.2沙棘H r T C P转录因子家族成员进化树分析
将沙棘11个H r T C P蛋白与拟南芥㊁水稻和枣T C P蛋白进行系统进化树分析㊂结果显示,沙棘T C P家族成员可分类为I亚族(P C F亚家族: H r T C P7/8/11/15/19/20)和I I亚族(C I N亚族: H r T C P2/4/13/17/18),同时发现沙棘㊁水稻㊁枣和拟南芥T C P家族基因呈现明显的聚类现象㊂此外,沙棘的每一条H r T C P序列都有与其较高相似度的
表1沙棘H r T C P s转录因子家族成员定量引物序列
T a b l e1 T h e f l u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e p r i m e r s f o r H r T C P4/7/19/20a n d H r U b i
基因G e n e上游引物F o r w a r d-p r i m e r(5'ң3')下游引物R e v e r s e-p r i m e r(5'ң3')
H r T C P4C A G G A C C C A A T T C T T C T T C G T T G C T G C T A T T C C A G A G
H r T C P7C T G C A T G T C T T G A C C A T A C T G C A T G T C T T G A C C A T A
H r T C P19C A A C C C A A A C A T C T C T A C C T C C T C T T T C A A T G G T A T G
H r T C P20G A A G C T C A A A C A A A G A C A T C T G G T T A A T T G G A A T A T T C T G
H r U b i T G C C T G A G G A T G T A T G C T A C C C A A A T A A G T C G C T G C C T
875西北植物学报41卷
表2 基于转录数据获得沙棘T C P 转录因子家族序列
T a b l e 2 T h e s e q u e n c e s o f T C P t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s b a s e d o n H i p p o p
h a e r h a m n o i d e s t r a n s c r i p t i o n a l d a t a 转录组基因I D 号
T r a n s c r i p
t o m e g e n e _I D 基因描述
D e s c r i p
t i o n 期望值
E -v a l u e 分数
S c o r e T R I N I T Y _D N 69757_c 0_g 2T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 1E -32113.7T R I N I T Y _D N 72787_c 0_g 2
T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 1E -38
133.2T R I N I T Y _D N 72787_c 0_g 10T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 6.6E -40137.1T R I N I T Y _D N 69208_c 2_g 5T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 2.5E -44151.4T R I N I T Y _D N 61689_c 0_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 1.1E -28100.6T R I N I T Y _D N 64240_c 3_g 2T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 2.5E -2796.2
T R I N I T Y _D N 63966_c 0_g 2T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 4.8E -33114.8T R I N I T Y _D N 57205_c 0_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 1.2E -38132.9T R I N I T Y _D N 59468_c 0_g 3T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 1.9E -29103.1T R I N I T Y _D N 70138_c 0_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 7.4E -1762.2T R I N I T Y _D N 70138_c 1_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 1.1E -31110.4T R I N I T Y _D N 43099_c 0_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 1.7E -29103.2T R I N I T Y _D N 63280_c 4_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 1.1E -2590.9T R I N I T Y _D N 72514_c 0_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 5.1E -38130.9T R I N I T Y _D N 72514_c 0_g 2T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 2.1E -38132.2T R I N I T Y _D N 71435_c 1_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 2.4E -29102.8T R I N I T Y _D N 71435_c 1_g 3T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 7.5E -2381.7T R I N I T Y _D N 61203_c 0_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 7.4E -30104.4T R I N I T Y _D N 67399_c 1_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 3.4E -32112T R I N I T Y _D N 62031_c 0_g 2T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 2.4E -2383.3T R I N I T Y _D N 71542_c 1_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 2.4E -2899.5T R I N I T Y _D N 74292_c 3_g 1T C P f a m i l y t r a n s c r i p
t i o n f a c t o r 9.7E -43146.3
表3 沙棘H r T C P 基因家族成员序列特征
T a b l e 3 C h a r a c t e r i z a t i o n o f H .r h a m n o i d e s H r T C P g e n e f a m i l y
转录组基因I D
T r a n s c r i p
t o m e g e n e _I D 基因
G e n e 氨基酸数
A m i n o a i d n u m b e r
分子量
M o l e c u l a r w e i g
h t /k D 等电点
I s o e l e t r i c p o i n t
N C B I 基因I D
A c c e s s i o n I D n u m b e r s
T R I N I T Y _D N 74292_c 3_g 1H r T C P 246650.357.15MW 261920T R I N I T Y _D N 69757_c 0_g 2H r T C P 4
46149.096.51MW 261912T R I N I T Y _D N 69208_c 2_g 5H r T C P 1843038.036.23MW 261914T R I N I T Y _D N 71435_c 1_g 1H r T C P 1337341.189.27MW 267258T R I N I T Y _D N 63280_c 4_g 1H r T C P 1740044.078.72MW 261916T R I N I T Y _D N 63966_c 0_g 2H r T C P 726927.349.72MW 267257T R I N I T Y _D N 59468_c 0_g 3H r T C P 859061.787.32MW 261917T R I N I T Y _D N 61203_c 0_g 1H r T C P 1121823.448.99MW 261918T R I N I T Y _D N 72787_c 0_g 2H r T C P 1527930.378.96MW 261913T R I N I T Y _D N 59468_c 0_g 3H r T C P 1941743.866.09MW 261915T R I N I T Y _D N 67399_c 1_g 1
H r T C P 20
324
35.23
9.02
MW 261919
9
754期 姚 莹,等:沙棘H r T C P 转录因子家族鉴定及其干旱胁迫下的表达分析
其他物种序列,如H r T C P 20与A t T C P 20,H r T C P 15与Z j T C P 15㊁O s T C P 14,H r T C P 17与Z j
T C P 5等㊂推测沙棘T C P 基因可能与同一分支上其他物种的同源基因具有相似的生物学功能(图1
)㊂2.3 沙棘H r T C P 蛋白的保守区域比对
对预测的11个H r T C P 转录因子的结构域进行分析表明,11个沙棘T C P 蛋白均含有一个结合D N A 和蛋白互作所必需的T C P 结构域,即b H L H 结构域,且该结构域参与D N A 结合及其二聚化,保守程度高,其碱性区域位于b H L H 结构域的N 端,
P C F 亚族成员(H r T C P 7/8/11/15/19/20
)在基本区域(B a s i c )缺少4个氨基酸,但均不缺少双螺旋区的氨基酸(图2
)㊂2.4 沙棘H r T C P X 家族蛋白保守基序分析基于M E M E 等软件分析11个沙棘H r T C P 家族成员,绘制H r T C P 家族成员单独构建的系统进
化树㊁序列结构及保守基序信息图谱(图3)
㊂H r T C P 基因家族单独构建的进化树与之前一致,总体上分为P C F 亚族和C I N 亚族㊂基因结构分析
表H r .沙棘;O s .水稻;A t .拟南芥;Z j
.枣图1 沙棘与其他物种T C P 转录因子家族进化分析
H r .H i p p o p h a e r h a m n o i d e s ;O s .O r y
z a s a t i v a ;A t .A r a b i d o p s i s t h a l i a n a ;Z j .Z i z i p h u s j u j
u b a F i g .1 A n e i g h b o r -j o i n i n g p h y l o g e n e t i c a n a l y
s i s o f T C P t r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y
i n H r T C P s a n d o t h e r p l a n t s 图2 沙棘T C P 蛋白保守结构域比对
F i g .2 A l i g
n m e n t o f c o n s e r v e d d o m a i n s o f T C P p r o t e i n s i n H .r h a m n o i d e
s 图3 沙棘H r T C P 转录因子家族结构及基序分析
F i g .3 A n a l y s i s o f g e n e s t r u c t u r e a n d m o t i f o f T C P t r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y
i n H .r h a m n o i d e s 085西 北 植 物 学 报 41卷
明T C P 家族11个成员均含有一个外显子和上/下游结构,但不同成员他们的外显子的长度及位置具有一定差异㊂共选取10个m o t i f
,并将保守基序分别命名为m o t i f 1-m o t i f 10㊂在H r T C P 蛋白中每个
蛋白均含有不同数量㊁不同种类的m o t i f ,11个蛋白
可能含有各自不同的功能特性㊂其中m o t i f 1㊁m o -
t i f 2和m o t i f 3比较典型,m o t i f 1存在于所有成员
中,m o t i f 2仅存在于P C F 亚族成员中,m o t i f 3仅存在于C I N 亚族成员中㊂H r T C P 4和H r T C P 7蛋白
只含有2个m o t i f ;H r T C P 15和H r T C P 11蛋白含
有3个m o t i f ;H r T C P 19和H r T C P 20蛋白含有4个
m o t i f ;H r T C P 8㊁H r T C P 13和H r T C P 2蛋白含有5
个m o t i f ;H r T C P 17和H r T C P 18蛋白含有6个m o t i f ,所含m o t i f 数量最多㊂通过进一步的分析发
现,11个H r T C P 蛋白均包含的m o t i f 1与T C P 蛋
白的b H L H 结构域序列高度一致㊂P C F 亚族成员
中m o t i f 1和m o t i f 2关联,C I N 家族成员的m o t i f 1
和m o t i f 3关联㊂其他m o t i f 只在某些T C P 蛋白中出现,且无规律性㊂对每个结构域进行分析发现,m o t i f 1含有50个氨基酸且保守性较高㊂
2.5 参与沙棘抗旱的H r T C P s 候选基因筛选
为了进一筛选沙棘中参与抗旱的关键基因,我们将沙棘T C P 家族11
个成员与其他物种参与抗旱
H r .沙棘;O s .水稻;A t .拟南芥;B p
.白桦;F m.水曲柳图4 响应沙棘干旱胁迫的H r T C P s 基因筛选
H r .H i p p o p h a e r h a m n o i d e s ;O s .O r y z a s a t i v a ;A t .A r a b i d o p
s i s t h a l i a n a ;B p .B e t u l a p l a t y p h y
l l a ;F m.F r a x i n u s m a n d s h u r i c a F i g .4 T h e s e l e c t i o n o f t h e g e n e s w h i c h h a v e r e s p
o n s e s t o d r o u g
h t s t r e s s 的T C P 成员进行聚类分析,发现H r T C P 4㊁H r T C P 7
㊁H r T C P 19和H r T C P 20分别于F m T C P 4㊁B p
T C P 7㊁O s T C P 19和A t T C P 20高度同源(图4)㊂由此推测H r T C P 4/7/19/20可能也具有调控沙棘抵御干旱
胁迫的生物学功能㊂
2.6 干旱和盐胁迫下H r T C P s 的表达分析
本研究采用实时荧光定量q R T-P C R 方法,对H r T C P 4/7/19/20的表达量进行分析㊂由图5可
以看出,在P E G 处理1h 后H r T C P 7/19/20基因
表达量分别是对照组表达量的2倍㊁22倍和24倍,在处理12h 后表达量降低㊂由此可见,
沙棘受到干旱胁迫后H r T C P 4/7/19/20的表达量会发生明显
的上调变化,其中H r T C P 20反应最为强烈;
在N a C l 处理后,H r T C P 4/7表达量整体呈下降趋势,而H r T C P 19/20呈上升趋势并在12h 达到峰值,
其中H r T C P 20表达量上升达到极显著水平㊂
2.7 激素处理后H r T C P s 基因的表达分析
本研究对A B A 和M e J A 处理后沙棘H r T C P 4
/*和**分别表示P <0.05㊁P <0.01;
下同图5 非生物胁迫处理下沙棘H r T C P 4/7/19/20
基因表达分析
*a n d **m e a n P <0.05,P <0.01,t h e s a m e a s b e l o w
F i g .5 E x p r e s s i o n a n a l y
s i s o f H r T C P 4/7/19/20i n H .r h a m n o i d e s u n d e r a b i o t i c s t r e s s e s
1
854期 姚 莹,等:沙棘H r T C P 转录因子家族鉴定及其干旱胁迫下的表达分析
图6激素处理下沙棘H r T C P4/7/19/20基因表达分析F i g.6 E x p r e s s i o n a n a l y s i s o f H r T C P4/7/19/20i n
H.r h a m n o i d e s u n d e r h o r m o n e t r e a t m e n t s
7/19/20的表达量分析发现,A B A处理后, H r T C P4/7/19/20基因在不同处理时期表达量有极大的差异(图6)㊂H r T C P4转录因子表达量下调且变化不显著,H r T C P7/19/20转录因子对A B A 处理反应较为敏感,在处理1h后表达量最高,分别是对照实验组的5倍㊁16倍和12倍,其中H r T C P19对A B A处理的反应最为强烈㊂M e J A处理后,H r T C P4表达量先上升后趋于平稳,而H r T C P7/19/20表达量升高较为显著,其中H r T C P20对M e J A处理的表达量升高达到极显著水平,在处理1h表达量最高,是对照组表达量的5倍左右㊂结果表明,H r T C P7/19/20受A B A诱导, H r T C P4/7/19/20受M e J A诱导(图6)㊂
3讨论
目前,T C P转录因子家族已相继在拟南芥[21]㊁棉花[22]㊁番茄[23]㊁黄瓜[24]及苹果[25]等物种中获得并鉴定,发现该家族在植物生长发育及抵御逆境胁迫中具有重要调控作用㊂沙棘作为中国重要的经济兼生态型树种,其具有抗旱㊁耐盐等特性,但其T C P 基因家族是否参与沙棘植株抵御逆境的响应还鲜见报道㊂鉴于此,本研究基于沙棘转录组数据,获得具有完整开放阅读框的11个T C P转录因子,该基因家族的成员数量相对较少,是否还有尚未发现的成员,有待进一步研究㊂同时发现沙棘H r T C P基因家族的11个成员,均含有b-H L H保守域㊁N-端碱性氨基酸区和D N A识别和结合位点,这与D e P a o l o 等的研究结果一致[26],表明该基因家族的作用方式比较相似㊂H r T C P蛋白质的亚细胞定位预测,发现有8个蛋白定位于细胞核内,这与茶树和草莓中T C P家族成员分布情况类似[17,27],进一步说明了其作为转录因子主要在细胞核内发挥调控功能㊂此外,对沙棘T C P转录因子家族进行系统进化树分析及基序分析发现不同成员含有不同基序,但同亚族的家族成员含有的基序较为一致,该结果与枣T C P 基因家族基序分布情况较吻合[28]㊂由此,我们推测这些基序的存在可能与其相应基因发挥的生物学功能密切相关㊂
早期研究发现植物中茉莉酸信号突变体具有更好的耐旱性,拟南芥中一类T C P s中A t T C P20可以通过与L O X2启动子结合调控茉莉酸途径[29];水稻O s T C P19基因介导A B I4通路可以提高水稻苗期和成熟期干旱胁迫耐受性[15];木本植物水曲柳中F m T C P4响应了寒冷㊁盐与干旱等非生物胁迫以及激素信号的诱导[30];白桦B p T C P7基因启动子序列含有干旱与低温响应元件,其在响应干旱和低温应答过程中起正调控作用[31]㊂鉴于此,本研究将水稻㊁水曲柳和白桦中参与抗旱功能的T C P基因与沙棘H r T C P s转录因子家族成员进行聚类分析,获得具同源一致性较高的4个关键基因(H r T C P4/7/ 19/20),推测沙棘中这几个关键基因可能在干旱胁迫响应中也发挥重要作用㊂
本研究利用q R T-P C R分析发现,P E G处理条件下,H r T C P4/7/19/20基因的表达量明显上调, H r T C P20反应最为强烈;N a C l处理条件下, H r T C P19/20表达量上调,而H r T C P4/7的表达量呈下调趋势,该结果与水稻㊁水曲柳和白桦树种等物种中T C P参与抗旱的功能结果一致㊂本研究中导致H r T C P s基因表达上调的原因可能是由于干旱和盐胁迫均能对植物产生一定的渗透作用,从而诱导了基因不同程度的表达,但是盐胁迫过程中会产生离子毒害等现象,从而引起基因在盐胁迫和干旱胁迫下的表达趋势不同[32]㊂此外,A B A和J A信号通路在植物响应干旱胁迫中起着重要作用,非生物胁迫的发生会迅速激活植物体内A B A和J A激
285西北植物学报41卷
素信号通路,使相关基因的转录水平发生变化[33]㊂本研究荧光定量结果显示,H r T C P4/7/19/20均受到脱落酸和茉莉酸甲酯激素的诱导,该结果与毛竹T C P转录因子成员介导A B A信号通路响应干旱胁迫结果一致[34]㊂另有研究发现拟南芥中m i R319靶向的T C P结合L O X2启动子并激活脂氧合酶的活性,促进J A的生物合成[35]㊂综上,T C P 转录因子家族成员可以参与相关激素的合成来抵御干旱胁迫,本研究结果进一步表明H r T C P4/7/19/ 20可能在A B A和J A激素介导的干旱胁迫响应中起正调控作用㊂这些现象为深入解析H r T C P转录因子家族的抗旱分子机制提供新的方向㊂
本研究首次鉴定了沙棘H r T C P转录因子家族结构特征,并对该基因家族在干旱㊁盐胁迫及激素A B A与J A诱导下的表达模式进行初步分析,发现H r T C P s转录因子与非生物胁迫和激素诱导密切相关,尤其沙棘转录因子H r T C P20基因是调控沙棘抗旱的关键基因,该研究结果为解析沙棘抗逆性分子机制提供理论基础,同时也为进一步培育沙棘抗逆性品种提供重要的基因资源㊂
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(编辑:宋亚珍)
485西北植物学报41卷。