重组GGPPS腺病毒载体的构建及其调节肝星状细胞活化的研究

重组GGPPS腺病毒载体的构建及其调节肝星状细胞活化的研
究
来珊珊;陈卫波;徐康;丁尧;沈宁;潘飞燕;李朝军;薛斌
【摘要】目的:构建携带人源ggpps基因的重组腺病毒并用其研究GGPPS对人肝星状细胞的活化作用.方法:利用PCR方法扩增ggpps基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成穿梭质粒pAdTrack-CMV-GGPPS.测序正确后,经PmeⅠ单酶切线性化的pAdTrack-CMV-GGPPS与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组.经PacⅠ酶切鉴定正确后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-GGPPS颗粒.利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生.用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并用免疫蛋白印迹和实时荧光定量PCR方法鉴定目的基因的表达.然后利用该病毒感染人肝星状细胞LX-2,观察对肝星状细胞的活化以及细胞外基质合成的影响.结果:成功地构建了携带ggpps基因的重组腺病毒,得到的病毒滴度经TCID50法检测为2.5×109 PFU/mL.该病毒能够在人源的肝脏细胞中成功表达GGPPS蛋白.在LX-2细胞中过量表达GGPPS可以促进肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)转分化成表达平滑肌肌动蛋白α(Alpha-Smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纤维细胞(Myofibroblast,MF),同时检测到胞外基质成分纤连蛋白( Fibronectin,FN)的表达量显著增加.结论:成功构建的重组GGPPS腺病毒能促进肝星状细胞的活化.%Objective: To construct the recombinant adenovirus vector containing human ggpps gene and study its effect on activation of HSCs. Methods: ggpps gene was obtained by PCR amplification and subcloned into adenovirus shuttle plas-mid of pAdTrack-CMV to form the shuttle vector of pAdTrack-CMV-GGPPS. After sequencing, it was
linearized with Pmel and co-transfected into E. Coli BJ5183 cells with adenovirus genomtc plasmid of pAdEasy-1 to achieve homologous recombination. The DNA of identified recombinant plasmid was digested with Pacl and then transfected into QBI-293A cells to package adenovirus carrying GGPPS. Generation of recombinant adenovirus was monitored by the expression ofgreen fluorescent protein. The titer of viral stock was determined by TCID50 assay. The expression of GGPPS in human hepatocyte after Ad-GGPPS infection was detected by Western Blotting and Real-time PCR. Activation of HSCs and synthesis of ECM were checked by Real-time PCR after Ad-GGPPS infection in LX -2. Results; The Ad-GGPPS was successfully constructed and the infective titer is 2. 5 × 109 PFU/mL. The expression of GGPPS in human hepatocyte infected by Ad-GGPPS was efficient. Over-expressed GGPPS in LX - 2 cell can promote the expression of ot-SMA, a reliable marker of stellate cell activation, and Fibronectin, the composition of ECM is significantly increased too. Conclusion; GGPPS promotes the activation of HSCs.
【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2011(034)004
【总页数】6页(P83-88)
【关键词】GGPPS;重组腺病毒;肝星状细胞
【作者】来珊珊;陈卫波;徐康;丁尧;沈宁;潘飞燕;李朝军;薛斌
【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046;分子医学生物技术江
苏省重点实验室,江苏南京210046;南京大学医学院,江苏南京210093;南京师范大
学生命科学学院,江苏南京210046;分子医学生物技术江苏省重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046;分子医学生物技术江苏省
重点实验室,江苏南京210046;南京大学医学院,江苏南京210093;南京师范大学生
命科学学院,江苏南京210046;分子医学生物技术江苏省重点实验室,江苏南京210046;南京大学医学院,江苏南京210093;江苏省医学分子技术实验室,江苏南京210093;南京大学医学院,江苏南京210093;江苏省医学分子技术实验室,江苏南京210093
【正文语种】中文
【中图分类】Q291
香叶基香叶基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)是由GGPPS的2.495 kb的cDNA编码的34 kDa的蛋白，可以催化一分子异戊烯
二磷酸和一分子法尼基二磷酸合成香叶基香叶基二磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGPP)［1］．GGPPS 能够导致如 Ras、Rho、Rac 和 Rap 等一类的小分子 Rho-GTP酶家族蛋白发生异戊二烯化修饰．这一类小G蛋白在真核
细胞中充当分子开关的作用，介导真核细胞许多重要的生物学功能．GGPPS在人体组织内广泛表达，但表达程度不同，其中在睾丸内表达水平最高，在心脏、肌肉组织内有中等水平的表达［2，3］．目前对GGPPS功能的研究主要集中在植物，而在哺乳动物细胞和个体水平则很少．我们实验室前期研究发现，GGPPS作为早期生长反应因子1(Early growth response factor 1，Egr-1)的直接下游调控基因，在香烟刺激的情况下被转录激活，参与对Ras的异戊二烯化修饰，进而调节
Ras/MAPK信号通路的活化［4］．为了进一步了解该基因的功能，本实验中我们
构建了GGPPS重组腺病毒质粒载体，并利用腺病毒的高转染性研究了其对肝星状细胞活化的影响．
大肠杆菌BJ5183、pAdEasy-1腺病毒骨架质粒以及含绿色荧光蛋白(GFP)的穿梭质粒pAdTrack-CMV，由本实验室保存．QBI-293A包装细胞购买自武汉细胞所．LX－2细胞由南大徐强教授惠赠．对照Ad-GFP由本实验室保存，滴度为1.2×109PFU/mL．限制性内切酶、T4DNA连接酶、小牛碱性磷酸酶(CIP)、高保真酶以及其他工具酶，均购自NEB公司．质粒提取与纯化回收试剂盒购自上海华舜生物有限公司．兔抗GGPPS多抗由本实验室自行制备．羊抗兔HRP二抗购买自凯基生物．ECL发光液购自CST公司．实时荧光定量PCR kit购自Bioneer公司．荧光定量PCR仪为ABI-7300．胎牛血清购自Wisent公司．细胞和细菌培养箱均为Thermo公司产品．
1.2.1 目的基因的扩增
以GenBank中人源ggpps基因序列为模板(Gene ID:9453)，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物，上游引物序列为:下游引物序列为:5'-以人源的WRL-68细胞mRNA反转录的cDNA样品为模板进行目的基因的PCR扩增，条件为:94℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环．
1.2.2 重组腺病毒质粒的构建与鉴定
根据AdEasyTMAdenoviral Vector System操作说明，利用NotI、XhoI两个双酶切位点将ggpps基因装入pAdTrack-CMV载体中，再用NotI、XhoI双酶切鉴定，重组的穿梭质粒命名为pAdTrack-CMV-GGPPS．用PmeI酶切该重组质粒和CIP酶去磷酸化后，用电穿孔法将其与质粒pAdEasy-1共同转化感受态菌BJ5183(条件:电脉冲25 μF、电压2.5 kV、电阻200 Ω)，完成同源重组．对同源重组后的质粒经PacI酶切鉴定．以碱裂解法大量抽提重组腺病毒质粒DNA备用．将构建成功的重组腺病毒质粒命名为pAd-GGPPS．
1.2.3 pAd-GGPPS转染QBI-293A细胞
将重组质粒用磷酸钙法［5］转染QBI-293A细胞，5%CO2，37℃静置培养．转染后不同时间，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的表达，了解腺病毒的包装过程．转染后7 d～10 d，细胞出现病理性变化(Cell pathological effect，CPE)，表现为贴壁细胞变圆、核浓缩、脱落，出现病毒空斑．待细胞CPE达到70%，离心收集细胞，于－70℃和4℃反复冻融3次，离心后收集上清于－70℃保存备用．该获得的重组病毒命名为Ad-GGPPS．
1.2.4 病毒滴度的测定(TCID50法)
Ad-GGPPS在QBI-293A细胞中扩增三代后利用半数组织培养感染量(Tissue culture infectious dose 50，TCID50)法检测腺病毒滴度．QBI-293A细胞用2%的胎牛血清培养基制成浓度约1×105/mL的细胞悬液，以100 μL每孔接种于96孔板(同时按10倍稀释制备病毒稀释液感染上述细胞)．每排前10孔各加入100 μL同一浓度的病毒稀释液，第11、12孔加入100 μL的2%胎牛血清培养基作为阴性对照．置于CO2培养箱37℃培养10 d，然后显微镜下观察每排细胞出现CPE的情况．
以发生CPE即为阳性作为判定标准．
按下列公式计算滴度:T=101+d(S－0.5)IU/mL．
其中:d为Log10稀释倍数;
S为从第一个稀释度起的阳性比率之和．
1.2.5 细胞培养
腺病毒感染所用细胞:QBI-293A，人源的肝细胞株WRL-68，人源的肝星状细胞LX－2，均以10%的胎牛血清培养基，5%CO2，37℃静置培养．
1.2.6 腺病毒感染
WRL-68细胞在感染病毒时换成无血清培养基，然后分别加入Ad-GGPPS和Ad-
GFP，待病毒感染2 h后补加血清至10%，24 h后观察绿色荧光．LX－2细胞在腺病毒感染前24 h换成0.3%的胎牛血清，加入腺病毒后继续培养24 h．
1.2.7 Western Blotting
培养的WRL-68细胞感染Ad-GGPPS 48 h后将培养基弃掉，用冰预冷的PBS洗两遍，加入500 μL裂解缓冲液(50 mmol/L HEPES、500 mmol/L NaCl、10 g/L NP40、1 mg/L aprotinin 及100 mg/L PMSF)，冰浴30 min，刮取细胞，以12 000 g离心15 min．收集上清，经蛋白定量后，加入5 μL 5×SDS上样缓冲液，99℃煮沸5 min．样品以10%的SDS-PAGE电泳，120 V恒压2 h，常规转膜，5%脱脂奶粉封闭，兔抗GGPPS(5%脱脂奶粉，1∶1 000稀释)抗体4℃孵育过夜，PBST洗脱10 min×3次，山羊抗兔HRP二抗(PBST，1∶3 000稀释)室温孵育1 h，PBST洗脱5 min×6次，ECL化学发光检测．
1.2.8 Real-time PCR检测
培养的WRL-68细胞感染Ad-GGPPS 48 h后将培养基弃掉，用冰预冷的PBS洗两遍，Trizol抽提RNA．RNA用NanoPhotometer(Implen公司)定量后取800 ng进行反转录．反转录采用TaKaRa公司的反转录试剂盒，37℃反应15 min，85℃ 5 s终止反应．Real-time PCR 反应体系为:2×SYBR green 10 μL，Primers 1 μL，50 ×ROX 0.4 μL，cDNA 1 μL，H2O 补平体积20 μL．检测时使用的引物序列见表1．
1.2.9 统计学分析
采用Excel 2003对实时荧光定量PCR的结果进行t检测．所有结果均以±S表示．多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义．
利用设计的引物从人源肝细胞WRL-68中PCR扩增出ggpps基因的产物大小约为900 bp(图1)．将其亚克隆至穿梭质粒中，构建成重组质粒pAdTrack-CMV-GGPPS，经NotI和XhoI酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，出现900 bp左右的条带
(图2)．通过测序进一步证实后，将重组质粒经PmeI单酶切线性化后与腺病毒基
因重组质粒在细菌内进行同源重组．挑选阳性菌落，质粒大提后经PacI酶切鉴定，重组病毒出现两条带，一条约为30 kb的大片段，另一条为4.5 kb或3.0 kb的小片段(图3)．
重组腺病毒在扩增三代后，进行滴度测定．依照TCID50法，在感染后第10 d观察CPE(图4)，计算每个稀释度产生的CPE的孔数，计算得到腺病毒的滴度为:
T=101+d(s－0.5)=101+1(8.6－0.5)=109.1(每100 μL 病毒储存液)．
T=1010.1TCID50/mL．
由于TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7，所以将TCID50/mL 转换成PFU/mL:T=1×1010.1－
0.7PFU/mL=1×109.4PFU/mL≈2.5×109PFU/mL．
分别提取感染Ad-GGPPS和Ad-GFP的WRL-68细胞与正常WRL-68细胞的总RNA和总蛋白质，分别进行Real-time PCR和Western blotting检测．结果显示，Ad-GGPPS感染的肝细胞中GGPPS的mRNA和蛋白质的表达都明显高于感染对照腺病毒Ad-GFP和正常的WRL-68细胞，该结果证实GGPPS重组腺病毒
在WRL-68细胞中成功表达GGPPS蛋白(图5)．
LX－2细胞是永生化的人源肝星状细胞株［6］．在慢性肝损伤引起的肝纤维化中，活化的HSCs是ECM的主要来源细胞．LX－2细胞具有原代培养的HSCs的特征，因此被广泛地应用于体外研究HSCs的活化和肝纤维化的发生．LX－2在10%胎
牛血清培养时，处于高度活化状态，呈纤维样，但在0.3%胎牛血清浓度培养时会逐渐丧失活化特征转变成未活化状态的HSCs［7］．根据上述的特点，我们用0.3%胎牛血清浓度培养LX－2细胞24 h使其去活化后，分别感染Ad-GGPPS腺病毒
和对照腺病毒Ad-GFP，24 h后提取总RNA．Real-time PCR检测发现过表达GGPPS可以促进HSCs的活化，其标志基因α-SMA的表达显著增加(p＜
0.05)(图6B)．HSCs活化后会分泌大量细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)，我们在对细胞外基质成分的检测中发现FN和I型胶原在过表达GGPPS的细胞中
都是升高的，其中FN的mRNA增加最为显著(P＜0.03)，I型胶原
(TypeⅠcollagen，ColⅠ)的表达尽管没有显著型差异，但也是增加的(图6C，D)．结果显示，GGPPS可以促进HSCs的活化．
GGPP是类异戊二烯化化合物的一种，在植物或某些细菌体内作为合成胡萝卜素和类萜类等物质的前体，但是在真核生物中主要参与对包括Rho/Rac、Rap和Rab
家族在内的多种蛋白质的翻译后修饰，即蛋白质的异戊二烯化修饰［8］．这一类蛋白属于小G蛋白家族，在真核细胞中充当分子开关的作用，介导真核细胞中许
多重要的生物学功能，如控制细胞的形状，调控细胞的收缩、运动和存活等．GGPPS是合成GGPP的关键酶，它催化法呢基焦磷酸与异戊烯焦磷酸的缩合反应而产生GGPP．Northern结果显示人GGPPS基因在心脏中表达最高，在脾、睾丸、脑、胎盘、肺、肝、骨胳肌、肾、胰腺等组织中为中度表达，而在其他组织中未见有明显的杂交带［9］．GGPPS的功能研究集中在植物体内，仅有少量报
道表明GGPPS在哺乳动物细胞和个体水平有功能．2006年Yoshida等［10］发现GGPPS在细胞接触诱导的成骨细胞MC3T3-E1的分化过程中mRNA和蛋白的表达水平都是降低的，但具体机制还不清楚［10］．我们实验室前期研究证明，GGPPS可以作为转录因子Egr-1的下游调控基因，通过Egr-1-GGPPS-MAPK信号通路在如吸烟导致的肺炎、II型糖尿病发生［4］中起调节作用．为了更好地研
究GGPPS的生物功能，我们选择构建了GGPPS基因的重组腺病毒，因为腺病毒在众多生物载体里以安全性较高(不整合到宿主的基因组中，仅瞬间表达)、转染效率高、宿主范围大、滴度高、稳定、不易致癌等优点被广泛地应用［11，12］．
肝纤维化是多种慢性肝疾病或肝损伤进展成肝硬化的共同病理基础与必经阶段．持续的肝损伤会引起大量细胞外基质的产生，特别是胶原蛋白类物质，导致肝脏内过
多ECM的沉积，肝脏的正常结构被破坏，形成肝纤维化［13］．HSCs是存在肝血窦内皮细胞与肝细胞间的Disse间隙中的一种维生素A储存细胞．其在肝细胞
损伤后开始活化、增殖、分泌细胞外基质．HSCs是在肝纤维化中起着决定作用的关键细胞．肝脏受损时，HSCs被激活并大量增殖，发生表型改变，转变成活化形式－肌成纤维细胞，分泌产生胶原、糖蛋白和蛋白多糖，同时表达多种细胞因子及受体．我们的实验结果表明，在去活化的LX－2细胞中过表达GGPPS可以促进HSCs活化．由于活化的HSCs能分泌产生大量的ECM，我们又检测了ECM成分FN和ColⅠ，结果进一步证明了GGPPS对HSCs的活化作用．已被证实有很多
信号通路参与到HSCs活化的过程，如 Rho/ROCK、Ras/ERK、PI-3K、
JAK/STAT3等［14-16］．例如Rho/ROCK 激活后可引发 ERK 的磷酸化级联反应，促使Raf-1-MEK-ERK相继磷酸化活化，ERK活化后移入胞核，引起HSCs
增殖等一系列反应．其中Rho是属于Ras超家族，它的功能的发挥需要被异戊二烯化修饰后转移到细胞膜上．Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK)是Rho-ROCK信号通路下游的靶效应分子，可接受Rho分子传递的活化信号，发生多个氨基酸位点磷酸化而激活，
并介导下游分子的磷酸化/脱磷酸化反应，参与到多种组织器官纤维化的发生．已
有研究证明，特异性ROCK阻断剂Y-27632能够明显抑制肝星状细胞活化，具有抗大鼠肝纤维化作用［17-20］．GGPPS是异戊二烯化修饰作用中的一个关键酶，我们猜测，GGPPS可能是通过调节Rho、Ras等在HSCs活化过程中起着分子开关作用的小G蛋白的活性参与到调控HSCs的活化过程之中，最终影响到肝纤维
化的发生．我们构建的Ad-GGPPS腺病毒，将为我们更加深入研究GGPPS在HSCs活化过程的作用机制提供便利．
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