农杆菌真空渗透法转化棉花花粉的初步研究

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棉花转基因技术的研究及应用

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关键词：棉花；遗传转化；究与应用研
中图分类号：５２０￥６．１文献标识码：Ａ文章编号：００— ０１２０）刊一０１０１０７９（０６增０４ — ５

棉花转化实验报告

棉花转化实验报告棉花转化实验报告一、引言棉花是世界上最重要的经济作物之一，广泛用于纺织品、纸张和食品工业。

然而，传统棉花种植面临着许多挑战，如病虫害、环境压力和耕地资源有限等。

因此，寻找一种高效的棉花转化方法，以提高产量和抗性，对于农业发展具有重要意义。

二、材料与方法本实验选取了常见的棉花品种作为研究对象，通过基因转化技术引入外源基因，以提高棉花的产量和抗性。

具体步骤如下：1. 构建转化载体：将目标基因与转化载体连接，构建出适合棉花转化的载体。

2. 组织培养：采集棉花幼胚作为外植体，在含有适当激素的培养基中进行愈伤组织的诱导和增殖。

3. 基因转化：将构建好的转化载体通过农杆菌介导法导入棉花愈伤组织细胞中，利用细胞的再生能力使转基因棉花植株产生。

4. 筛选转基因植株：通过对转基因植株进行筛选，利用PCR等方法检测目标基因是否成功转化。

5. 鉴定转基因植株：通过观察转基因植株的形态特征、生长情况和抗性等性状，对转基因棉花进行鉴定。

三、结果与讨论经过一系列的实验操作，我们成功地将外源基因导入了棉花植株中，并获得了转基因棉花。

通过PCR分析，我们确认了目标基因的存在。

在鉴定转基因棉花的过程中，我们观察到转基因植株在生长速度、花期和产量等方面均表现出了显著的改善。

同时，转基因棉花还表现出更好的抗虫性和耐逆性，对病虫害的抵抗能力明显增强。

这一实验结果表明，通过基因转化技术可以有效地提高棉花的产量和抗性。

转基因棉花具有广阔的应用前景，可以为农业生产带来诸多益处。

然而，我们也应该注意到转基因技术的潜在风险和争议。

在推广应用转基因棉花之前，需要进行更多的安全性评估和环境影响研究，以确保其对人类和环境的安全性。

四、结论本实验通过基因转化技术成功地将外源基因导入棉花植株中，获得了转基因棉花，并证实了转基因棉花在产量和抗性方面的优势。

这一研究为棉花种植的发展提供了新的思路和方法。

然而，转基因技术的应用仍需要更多的研究和评估，以确保其安全性和可持续性。

农杆菌介导的植酸酶基因转化棉花的研究

0引言棉花是喜磷作物，其一生中吸收的磷素70%~90%来自土壤，中国棉协统计2007年中国棉花种植面积为544万hm 2，按磷肥施用量一般在18kg/667m 2左右，中国棉花每年要施用约147万t 。

但磷肥施入土壤后，由于磷酸盐的化学行为使其成为作物难以利用的难溶性磷，肥料的当季利用率仅为10%~15%，造成土壤中的总磷量远高于有效磷含量。

所以，创造磷高效利用的棉花种质资源，保证棉花生长后期有充足的磷素供应，对棉花的高产优质是至关重要的。

自1987年首次报道利用农杆菌介导法将NPTII 基因和CAT 基因导入陆地棉品种Coker312、310以来[1]，棉花基因工程研究飞速发展。

同年，Fioozabady 等[2]用珂字201子叶组织作为外植体，转入NPT Ⅱ基因。

Bayley 等[3]用农杆菌介导转化珂字312，得到了抗2,4-D 的转基因植株。

1990年，Perlak 等[4]利用农杆菌介导法将Bt 基因导入棉花基因组中，获得了抗性稳定的并可通过种子遗传的抗虫棉。

国内，陈志贤等[5]利用农杆菌介导法将抗除草剂基因(tfdA)成功转入晋棉7号，获得了抗2,4-D 的转基因棉花。

“抗虫棉之父”郭三堆于1993年底研制成功的基金项目：转基因生物新品种培育重大专项；河北省科技支撑计划重大项目（06220113D ）；河北省自然科学基金重点项目（C2006001034）。

第一作者简介：郭彩菊，女，1981年出生，农学硕士，主要从事棉花分子育种研究。

通信地址：071001河北保定市河北农业大学西校区农学院，E-mail ：guocaijuhappy@ 。

通讯作者：马峙英，男，1958年出生，博士，教授，博士生导师，主要从事棉花育种研究。

通信地址：071001河北保定市河北农业大学西校区农学院，E-mail ：mzhy@ 。

收稿日期：2009-05-22，修回日期：2009-06-10。

农杆菌介导的植酸酶基因转化棉花的研究郭彩菊，王省芬，张桂寅，迟吉娜，吴立强，李志坤，马峙英（河北省作物种质资源重点实验室/河北农业大学，保定071001）摘要：为建立一种转化效率高、稳定性好的棉花农杆菌遗传转化体系，以优良的陆地棉品种晋棉14、陕724为受体材料，利用农杆菌介导的方法，将含有根特异性表达启动子的植酸酶基因(PhyA )转入供试品种的胚性愈伤中；对获得的再生植株进行PCR 检测，证明PhyA 已经被插入到棉花基因组中，晋棉14和陕724的转化效率分别为33%和8.3%；此外，还对影响农杆菌侵染棉花胚性愈伤转化效率的因素，如卡那霉素浓度、胚性愈伤组织生长状态、受体材料的基因型等进行了较为系统的比较研究。

农杆菌与质粒DNA子房注射法在棉花转基因研究中的应用

农杆菌与质粒DNA子房注射法在棉花转基因研究中的应用作者：匡政成等来源：《湖南农业科学》2014年第04期摘要：为了研究农杆菌和质粒DNA两种子房注射法对普通棉花品种的转化效率，以8891棉花为材料，分别在三亚和常德两地进行了转化试验。

结果表明：与质粒DNA注射相比，三亚地区农杆菌注射的转化效率高1.25个百分点；但农杆菌子房注射的落铃率高，获得的种子相对较少；而在不同的地点试验，常德地区的落铃率显著高于三亚地区；而质粒DNA直接注射的成铃率更高，虽然转化率相对较低，但也能获得有效的转化植株。

关键词：农杆菌子房注射；质粒DNA子房注射；棉花；遗传转化中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2014）04-0031-03Abstract： In order to study the transformation efficiency of two ovary injection methods （with Agrobacterium tumefaciens or with plasmid DNA） to normal cotton variety 8891， the transformation experiments were conducted in Sanya and Changde， respectively. The results showed that the ovary injection with Agrobacterium tumefaciens in Sanya increased the transformation efficiency by 1.25 percentage points， but it had relatively higher boll shedding rate which causing relatively less seeds， moreover， the boll shedding rate in Changde was significantly higher than that in Sanya； ovary injection with plasmid DNA had relatively higher boll setting rate， and it can obtain the effective transformation plant although the transformation efficiency was relatively lower.Key words： ovary injection with Agrobacterium tumefaciens； ovary injection with plasmid DNA； cotton； genetic transformation转基因抗虫棉是目前转基因成功并广泛推广种植的作物之一[1]，其种植面积已占我国棉花总种植面积的70%，超过了200万hm2。

农杆菌介导SlNAC1基因转化棉花的研究

ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙＳｔｕｄｉｅｓｏｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＣｏｔｔｏｎｗｉｔｈＳＩＮＡＣ１Ｇｅｎｅ
ＭｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＨｕａｎｇＹｕｎ，ＬａｎＪｉａｙａｎｇ，ＣｈｅｎＱｕａｎｑｉｕ，ＦｕＪｉａｐｉｎｇ，ＺｈａｎＸｉａｎｊｉｎ
摘要：本实验在无菌条件下，以棉花下胚轴为外植体，利用农杆菌介导转化番茄ＳｌＮＡＣ１基因，通过愈伤组
为棉花抗逆育种工作提供了新的选择。
１材料与方法
１．１供试的棉花品种
本课题保存的珂字棉３１２（Ｃｏｋｅｒ３１２）自交系。
１．２根癌农杆菌及质粒
农杆菌菌株ＧＶ３１０１由武汉双螺旋生物科技有限公司惠赠。质粒ｐＢＩＮＡＣ１由华中农业大学欧阳波课题组改造并提供。。］，含有ＮＡＣ１基因。图１
织培养、分化及ＰＣＲ检测棉花幼苗获得了Ｔ。代的阳性转基因棉花植６７株。
关键词：棉花；ＳｌＮＡＣ１；农杆菌；转化中图分类号：￥５６２．０３５．３文献标志码：Ａ文章编号：１０００ — ６３２Ｘ（２０１４）０３ — ００１５ — ０３

农杆菌介导棉花遗传转化体系优化

农杆菌介导棉花遗传转化体系优化棉花纤维是纺织工业的重要原料,利用基因工程的方法遗传改良棉花纤维品质是棉花分子育种的重要方向。

GbMYB2基因cDNA是从海岛棉中克隆出一段长度为747bp的开放读码框,本实验室前期的研究结果证实:在拟南芥中过量表达GbMYB2基因能够能够增加表皮毛的数目、根的长度。

为了进一步研究GbMYB2基因在棉花中的功能,本研究在完善棉花遗传转化体系的同时,利用农杆菌遗传转化的方法将其转入棉花获得转基因的植株。

农杆菌介导的棉花遗传转化体系通常以下胚轴为外植体,经历愈伤组织、胚性愈伤组织、体胚胎发生等过程获得再生植株。

但该遗传转化体系通常受到基因型限制、转化周期长、成胚率低等因素的限制。

为了解决上述有关问题,本文在前人的工作基础上对体系进行优化,分别从两个方面(以胚性愈伤为受体的转化体系和以茎尖为受体)对农杆菌的遗传转化体系进行了探讨,结果如下:1.对以下胚轴为受体的遗传转化体系进行了优化:首先,针对棉花遗传转化体系的面临的转化效率低的问题,对外植体、农杆菌浓度、共培养时间、农杆菌菌株、C源以及凝固剂等进行研究和对比,结果显示:50mg/L卡纳霉素可以有效筛选抗性愈伤组织;下胚轴是该转化体系的最佳外植体;LBA4405和EHA105均可作为该转化体系的工程菌菌株;农杆菌浓度控制在OD600为0.5左右;最佳共培养时间为48h；以葡萄糖为C源可减少褐化。

其次，针对转化体系中转化周期长和工作量大的问题，对继代次数以及不同形态的非胚性愈伤组织产胚能力以及生长速度等进行了分析，结果显示：MSB5培养基继代次数两次；绿色和灰色相间的颗粒状非胚性愈伤组织生长速度和产胚能力最高；对非胚性愈伤及时进行分化培养可缩短转化周期；最后，针对转化体系中畸形胚发生率高的问题，对转化程序进行了优化，结果显示：应在加有滤纸的分化培养基上诱导产生胚后及时转入营养物质充足在的未加滤纸的培养基中进一步培养，并及时转接。

农业棉花的实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 了解转基因技术在农业棉花中的应用原理和方法。

2. 探究抗虫、耐除草剂转基因棉花在提高棉花产量和品质方面的效果。

3. 为我国农业棉花种植提供科学依据和技术支持。

二、实验材料1. 棉花品种：选用我国常见的棉花品种，如中棉所12、新陆中35等。

2. 抗虫、耐除草剂基因：选取具有抗虫、耐除草剂性状的基因，如Bt基因、草甘膦抗性基因等。

3. 转基因载体：采用农杆菌介导法，构建含有目的基因的转基因载体。

4. 实验仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜等。

三、实验方法1. 基因克隆与表达载体制备（1）设计并合成引物，进行目的基因的PCR扩增。

（2）将扩增产物与载体连接，构建重组质粒。

（3）将重组质粒转化农杆菌，筛选阳性克隆。

2. 农杆菌介导转化（1）将筛选得到的阳性克隆质粒转化农杆菌。

（2）将转化后的农杆菌涂布于含有抗生素的琼脂平板上，筛选阳性转化子。

3. 转基因棉花植株的再生与筛选（1）将阳性转化子接种于含有抗生素的MS培养基上，进行愈伤组织诱导。

（2）将愈伤组织分化成再生植株。

（3）对再生植株进行PCR检测，筛选转基因植株。

4. 抗虫、耐除草剂性状鉴定（1）观察转基因植株与对照植株的生长状况、叶片形态、花果形态等。

（2）对转基因植株进行虫害和除草剂耐受性测试。

（3）检测转基因植株的棉花产量和品质。

四、实验结果与分析1. 转基因载体构建与转化成功构建了含有抗虫、耐除草剂基因的转基因载体，并转化农杆菌。

2. 转基因植株再生与筛选获得了一批转基因植株，PCR检测结果均为阳性。

3. 抗虫、耐除草剂性状鉴定（1）转基因植株生长状况良好，叶片形态与对照植株相似。

（2）转基因植株对虫害和除草剂具有较高的耐受性。

（3）转基因植株的棉花产量和品质均优于对照植株。

五、结论1. 成功构建了抗虫、耐除草剂转基因棉花，为我国农业棉花种植提供了新的技术途径。

2. 转基因棉花在提高棉花产量、提升棉花品质、降低农药使用量等方面具有显著效果。

农杆菌真空渗透法转化花粉获得棉花转acsB基因植株

带的载体有一个Ｇ，【．因、潮霉素抗性基因和从ｓ基
Ｌ）ＭＳ培养基中。暗培养３的天后，移至光下（度温２ ℃ ，光暗比为１／）８６８，观察种子的萌发及无菌苗
的生长情况。
木质醋杆菌中克隆的纤维素合成酶基因ａｓｃＢ；基因
素梯度浓度液（５／１０ｍｇＬ，３０ｍｇＬ，５０ｍｇＬ，０／０／７０ｍｇＬ，１０／，～５０／００ｍｇＬ）３天后观察被涂抹叶片的敏感性，以选择最适浓度潮霉素，用于转化体的第２筛选。次１３２转化体的Ｇ，．．【ｓ组织化学检测．外源基因（ｃＢ）体ｐＡＭＢＡ１０质粒除了潮霉素抗性基ａｓ载ＣＩ３１
从固体平板上挑取农杆菌单菌落，在液体培养
基中培养，当菌液的ＯＤ。值为０５０８，离心。．～．时
（００ｒｍｉ３０／ｎ，１ｉ）集菌体，重悬于花粉萌发０ｒｎ收ａ
简报ｌ
寻｛＿三｝｝三卜
李晓王学德朱玉贤卢迎春赵向前
（浙江大学农业与生物技术学院，江杭州３０２；北京大学生命科学学院，京１０７）浙１０９北０８１
ＴｒｎｓｅｃａｓＣｏｔｎａｇｎｉｃＢｔｏＰｌｎｔｓＯｂａｎｄｂＶａｕｍｎｆｌｒｔｏｆＰｏｎａｔｉｅｙｃｕＩｉｔａｉｎｏｌｗｉｈｌｅｔ

农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法[发明专利]

专利名称：农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法
专利类型：发明专利
发明人：杨晓凤,邱龙,陈凯,旷乐,章旺根,成雄鹰,马崇烈申请号：CN201610059858.4
申请日：20160128
公开号：CN107012162A
公开日：
20170804
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，首次采用吸胀但未萌发的胚尖作为外植体材料，经农杆菌侵染、共培养、筛选、生根、移栽等步骤，获得转基因棉花植株。

本方法具有操作简单、转化周期短的优点。

利用本方法在4个月即可获得转化植株，而常规棉花转化周期一般为5个月以上，本方法大大缩短了转基因棉花的获取周期，提高了转化效率。

另外，利用本方法进行转化不受棉花基因型限制，为实现大规模转基因棉花生产、育种提供了可能。

申请人：中国种子集团有限公司
地址：100045 北京市西城区复兴门外大街A2号中化大厦15层
国籍：CN
代理机构：北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：王文君
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农杆菌介导法转hpalxoo基因棉花再生植株建立及转hpalxoo基因棉细胞组织抗病表型鉴定

农杆菌介导法转hpalxoo基因棉花再生植株建立及转hpalxoo基因棉细胞组织抗病表型鉴定棉花黄、枯萎病是危害棉花维管组织的两种真菌类病害,在全国棉区均有分布,它们通过病原真菌堵塞导管、产生毒素等多种形式危害棉株。

在棉花生长前期可造成死苗,中后期引起蕾铃脱落,导致产量、品质严重下降。

培育和推广转基因抗病品种是防治棉花黄、枯萎病简单易行且行之有效的方法。

Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的富含甘氨酸、对热稳定但对蛋白酶K 敏感的一类蛋白。

它在非寄主植物上能够引起过敏反应,而且很可能是植物病原细菌的一个重要的致病因子。

另外,harpin蛋白还能够诱导植物产生病虫抗性以及提高作物的产量与品质。

农杆菌介导法转hpa1xoo基因棉花再生植株的建立。

本实验以中棉所35号为转化受体品种,采用农杆菌介导法将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas. oryzae pv. oryzae)的hpalxoo基因全长hpalxoo和其缺失片断CD转化棉花茎尖外植体及下胚轴外植体。

通过对影响组织培养和转化的相关因素的研究,建立起了适宜农杆菌介导的茎尖、下胚轴遗传转化体系。

主要研究结果如下:建立了以棉花茎尖为受体的转化体系。

通过对影响转化频率相关因子的研究,以及对头孢霉素(Cef)抑菌浓度、卡那霉素(Km)筛选浓度、农杆菌菌株的比较筛选,获得了hpalxoo的转化株,PCR扩增到了目的基因,证明了棉花茎尖可做为良好的受体材料并且获得了根癌农杆菌介导的茎尖转化体系:未经预培养的带下胚轴0.5cm的茎尖在OD600=0.3-0.35的根癌农杆菌菌液中浸染15-20min,共培养48-56h;选择培养以500mg/LCef为抑菌浓度,150mg/LKm为最高筛选浓度;两种菌株比较结果hpa1xoo的侵染转化率高于CD。

采用农杆菌转化胚性愈伤,只要选择的细胞分裂状态比较适当,能获得大量独立的转化子,且经过2～4次筛选便可进入分化培养,仅需5～6个月便可获得再生植株,大大缩短了棉花转基因周期。

花粉管通道法转基因棉花后代筛选鉴定

花粉管通道法转基因棉花后代筛选鉴定李忠旺;厚毅清;石有太;罗俊杰;陈玉梁【摘要】The smear test of Kan concentration gradient was conducted in brown cotton BC05 leaves,then the best screening concentration of 3.0 g/L and the best observation time of fifth day were obtained.Through the PCR identification in Kan-resistant plants,the results showed that the method was able to identify whether plant is genetically modified material or non-GM material.But whether the target gene was successfully integrated was remain to be identified by PCR.Therefore,the kanamycin screening combining with PCR molecular identification is an effective method to screened large groups of genetically modified cotton offspring.%通过对棕色棉BC05叶片进行Kan浓度梯度涂抹实验,确定了Kan涂抹筛选的最佳浓度为3.0 g/L,最佳观察时间为涂抹第5天。

对Kan抗性植株进行PCR鉴定表明,Kan涂抹筛选可基本准确的鉴别出转基因材料与非转基因材料,但目标基因是否成功整合还必须进行PCR鉴定,田间卡那霉素筛选结合PCR分子鉴定是转基因棉花后代大规模群体筛选的有效方法。

农杆菌真空渗透法转化花粉获得棉花转acsB基因植株

lImnoo1 pANG mqerse1 tuv wqrmnox2 lv wnxyrCzqx2 tuAO mnoxyr{nox1
C1|}~tofAgricultur},Biot}chnology,Zh}jiangUniv}rsityHangzhou,D10029E2|}~t.ofBiology,P}kingUniv}rsity100871,ChinaF
byvacuum infiltrationofpollenwithAgrobacterium tumefaciens
授粉子房数
No.of pollinated
ovary
结铃数
No.of effective
boll
结铃率
Rateof effective boll(% )
畸形铃数
No.of abnormal
别用 HindⅢ 和 BamHⅠ 于 37℃酶切过夜,经电泳分开后转印于尼龙膜,预杂交、杂交和探针的同位素标记均按 Fermentas试剂盒说明书进行。杂交膜用 2倍的 SSC、0.1%SDS(5min,2次),以及 0.1 倍的 SSC、0.1%SDS(68℃,15min,2次)的溶液漂洗后,压 X射线片进行放射自显影后观察结果。经潮霉素抗性、GUS表达、PCR 产物和 Southern 杂交检测均为阳性的转化体 ,定为转基因棉花。
够发芽和生长,且胚根亦不会褐化,与对照相比只是生长速度稍慢。30mg/L潮霉素对未转化种子的发芽已有一定的影响 ,但有一部分棉花种子还是能发芽和生长,但胚根褐化,下胚轴生长缓慢。50 mg/L和 100mg/L的潮霉素浓度不论对未转化种子的发芽还是对苗的生长都有很大的影响 ,胚根一接触培养基就立即褐化,胚轴生长停滞。因此,50 mg/L的潮霉素浓度对转化种子进行筛选最为适