纳米仿生组织工程血管体外构建的实验研究

纳米仿生组织工程血管体外构建的实验研究
郑晓兵#乔彤冉峰刘长建
【摘要】目的利用静电纺丝（electrospinning，ELSP）技术构建具有纳米结构的纳米仿生组织工程血管（nano-biomimetic -tissue engineered blood vessel，NBTEBV）。

方法6月龄新西兰雄性家兔30只，体重2.15～3.10 kg。

制备
兔血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）体外培养育种管型模具；采用多排喷头ELSP混纺兔平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）悬液及仿ECM（mimic ECM，MECM）溶液构建NBTEBV。

NBTEBV用生物反应器体外培养，MTT检测静置24 h和动态培养7 d后NBTEBV上VEC/VSMC的成活和增殖能力，行HE染色、扫描电镜观察及最大抗张
力检测。

结果动态培养第7天的NBTEBV长57 mm，外径4 mm，壁厚0.4 mm，色乳白，质地均匀，具有良好的柔韧性
及弹性。

静置孵育24 h MTT检测血管上成活细胞相对数为3.5×105/mg，动态培养7 d后为8.9×106 /mg。

扫描电镜及HE
染色观察示NBTEBV与天然血管有相似的纳米结构及组织学特点；电镜结构呈现由100 nm支架纤维构成的孔径约600 nm
的网状结构；HE染色示VEC和VSMC分层构建成血管状。

动态培养第7天组织工程血管最大静水压为950 mmHg，拟生
理血压下（110/70 mmHg）管径顺应变化率3.0%；20 mm × 5 mm组织片最大抗张强度为18.5 MPa。

结论利用ELSP
技术可以将VSMC和MECM的支架材料同步构建成具有与天然血管相似纳米结构的组织工程血管。

　【关键词】纳米仿生组织工程血管静电纺丝兔
中图分类号： Q813.1 R318 文献标志码：A
EXPERIMENTAL STUDY ON TISSUE ENGINEERED BLOOD VESSEL RECONSTRUCTION WITH BIONANO-TECHNOLOGY /ZHENG Xiaobing, QIAO Tong, RAN Feng, LIU Changjian. Department of Vascular Surgery, the Affiliated Drum Tower Hosptial of Najing University Medical College, Nanjing Jiangsu, 210008, P.R. China.Corresponding author:LIU Changjian, E-mail:dr_cjliu@
【Abstract】 Objective To build nano-biomimetic tissue engineered blood vessel (NBTEBV) with nanotopology by us-ing electrospinning (ELSP) technology. Methods Cony vascular endothelial cell(VEC) on tubiform tooting in vitro was cultured. NBTEBV was built by use of multi-row nozzle with the suspension of cony vascular smooth muscle cell (VSMC) and mimic ECM (MECM) solution. NBTEBV was cultured with bioreactor in vitro. VEC and VSMC viability and proliferation were observed with MTT; and HE staining, scanning electron microscopy(SEM) observation and biomechanical test were carried out after 24 hours of static culture and 7 days of dynamic culture. Results After 7 days of culture, the length of NBTEBV was 57 mm, the external diameter was 4 mm and the thickness of wall was 0.4 mm. The NBTEBV’s color was white and the texture was even and flexible. MTT results indicated the viability of cells cultured on NBTEBV for 7 days was normal(8.9 × 106 /mg, 3.5 × 105/mg for 24 hours). SEM and HE staining indicated that the topologic character of NBTEBV was similar to that of the natural blood vessel. The NBTEBV showed a network scaffolds structure with 100 nm thick fiber and 600 nm aperture. The HE staining result showed that the NBTEBV was composed of VEC and VSMC by layer. Vascular mechanical results showed that the NBTE-BV ultimate hydrostatic pressure was 950 mmHg, the compliance of the NBTEBV under physio-pressure (110/70 mmHg) was 3.0%; the ultimate tensile strength of 20 mm × 5 mm tissue slice was 18.5 MPa. Conclusion The technology of ELSP can use VSMC and MECM scaffold simultaneously to build tissue engineered blood vessel with nanotopology mimic native blood vessel.
　【Key words】 Nano-biomimetic tissue engineeed blood vessel Electrospinning Rabbit
　Foundation item: Natural Science Foundation from Health Department of Jiangsu Province(K200609)
组织工程学是在生物医学工程中发展起来的一门新兴学科，并取得了重大进展，其概念的提出及技术的逐渐成熟使体外培植具有生物活性，且结构、功能与自
基金项目：江苏省卫生厅自然科学基金资助项目（K200609）
作者单位：南京大学附属鼓楼医院血管外科（南京，210008）
#现在南通大学附属医院
通讯作者：刘长建，教授，博士导师，研究方向：血管代用品，E-mail: dr_cjliu@
体血管相类似的人工血管成为可能[1]。

天然血管ECM 呈纳米级构造，利用不同纳米技术构建组织工程器官是组织工程发展的新趋势[2]。

我们实验应用静电纺丝（electrospinning，ELSP）技术将平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）、内皮细胞和仿ECM（mimic ECM, MECM）蛋白成分同步构建成纳米仿生组织工程血管（nano-biomimetic tissue engineered blood vessel，NBTEBV），为组织工程血管构建提供了一种新方法。

1材料与方法
1.1实验动物和主要材料、仪器
6月龄新西兰雄性家兔30只，体重2.15～ 3.10 kg，由南京军区总医院动物实验科提供。

PLGA（75∶25，相对分子质量110×103，抚顺天元生物材料有限公司）；Ⅰ型胶原、VB-钙黏素、DMEM 培养液（Gibco公司，美国）；纤粘连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、弹性蛋白、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Sigma公司，美国）；FBS（Hyclone公司，美国）；MTT溶液（中国医学科学院基础医学细胞中心）；分析级六氟异丙醇（hexafluoroisopropanol，HFIP，珠海顺义化工公司）；凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；内皮素（endothelin，ET）放射免疫试剂盒（解放军总医院科技开发中心）；α-肌动蛋白抗体、SABC免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

超净台（Labconco公司，美国）；CO2培养箱（Jouan 公司，法国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；S-520 型扫描电镜、JEM 22000EX型透射电镜（Hitachi公司，日本）；电纺仪（苏州大学材料工程学院）。

1.2兔血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）体外培养育种管型模具的制备
1.2.1VEC分离、培养与鉴定实验动物戊巴比妥钠（30～40 mg/kg）麻醉后，于无菌条件下取出左股动脉，迅速放入PBS 液中。

将血管翻转，冲净内壁后，放入1 mg/mL Ⅰ型胶原酶、4 mg/mL小牛血清白蛋白的DMEM 培养液中，置于37℃、5%CO2条件下25 min。

收集消化液并以离心半径22.5 cm，1 500 r/min离心25 min，将离心下的兔股动脉VEC吹打均匀，加入到含20%FBS的DMEM 中。

当细胞融合为单层时，0.125% 胰蛋白酶消化传代。

VEC通过透射电镜观察，用凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色、ET放射免疫法鉴定。

1.2.2VEC育种管型模具外壁 VEC经0.25%胰蛋白酶消化，计数细胞悬液浓度为3×106/mL。

将细胞悬液注入培养管与管型模具间的间隙（模具由钛合金制成，直径3.5 mm，管外壁涂有薄层纤粘连蛋白，管壁布满直径20 μm微孔），见图1。

再用DMEM培养液注满间隙。

置于37℃孵箱中，每30分钟旋转90°，重复4 h，以后每12小时旋转180°，培养3 d后取出外壁种有VEC的管型模具，浸入DMEM 培养液备用。

1.3多排喷头ELSP混纺兔VSMC及MECM构建NBTEBV
1.3.1兔VSMC分离、培养和鉴定无菌条件下，迅速将先前取出的兔股动脉，置入盛有PBS 液的平皿中。

洗净血块，剥除外膜，将血管翻转内膜面朝外，用刀片
自上而下刮1～2 遍，去除VEC。

然后用显微镊撕下
血管中膜的平滑肌层，剪碎为1 mm3，接种于培养瓶中，
在5％CO2培养箱中放置3 h，使组织块较牢固地黏附于瓶壁，加入含10% FBS的DMEM 培养液，3～4 d更
换含培养液1次。

细胞生长形成致密单层时，用0.125%
胰蛋白酶消化，按1∶2 比例传代培养，5～6 d可继
续传代1次。

透射电镜观察，VSMC 行抗α-肌动蛋白SABC 法免疫组织化学染色鉴定。

实验采用第2～3 代细胞进行研究。

1.3.2ELSP液制备①VSMC悬液制备：将VSMC (7.5×106/mL)加入含10%FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM 培养液制成电纺细胞悬液备用。

②MECM/ PLGA电纺溶液制备：将0.6 g PLGA、0.45 g Ⅰ型胶原蛋白、0.02 g纤粘连蛋白、0.01 g层粘连蛋白、0.02 g蛋
白聚糖、0.05 g弹性蛋白、2 μg VB-钙黏素溶解于分析
级HFIP，制成8%质量容积比溶液备用。

1.3.3多喷排头ELSP构建NBTEBV 将外壁种有VEC的管型模具安装至电纺仪作为旋转接收靶屏，转速250 r/min，接收屏沿轴向往返运动，往返距离6 cm，速度1.6 mm/s（图2）。

管型模具管腔通过连接管（连接管可沿长轴旋转）与DMEM培养液供应泵槽连接，泵供液速
度0.1 mL/min，补充电纺过程中培养液的损耗。

将先前
制备的VSMC悬液及MECM/PLGA溶液分别装入无菌
微量注射泵。

VSMC悬液泵喷头内径0.8 mm接8.5 kV
直流高压，喷头距靶屏4.5 cm，泵供应速度0.1 mL/min。

MECM/PLGA溶液泵喷头内径0.2 mm接18 kV直流高压，喷头距靶屏15 cm，泵供应速度1.5 mL/min。

电纺时长25 min。

1.4 NBTEBV生物反应器体外培养
从电纺仪上取下管型模具，经DMEM轻柔液漂洗3遍后立即浸入DMEM培养液，37℃静置孵育24 h，接着从管型模具上小心抽剥出电纺构建的组织工程血管（长6 cm），然后截取3 mm长组织工程血管作细胞学实验，MTT法测定组织工程血管上VEC/VSMC成活和增殖能力，3 mL VEC/VSMC混合悬液（VEC浓度3×106/mL、VSMC浓度7.5×106/mL）作为细胞计数参照；2 mm3组织块作HE染色；1 mm3组织块作扫描电镜观察。

其余55 mm长组织工程血管立即接入生物反应器（图3），培养槽及管道内充满37℃的DMEM条件培养液，启动装置的蠕动泵进行动态培养，蠕动频率1 Hz，蠕动压开始1～2 kPa，以后每隔24 h提高1倍。

1.5动态培养后NBTEBV组织学观察及力学检测
动态培养7 d后取下组织工程血管，截取3 mm长
组织片作细胞学实验，MTT法测定组织工程血管上VEC/VSMC成活和增殖能力；2 mm3组织块作HE染色；1 mm3组织块作扫描电镜观察。

其余组织20 mm 管状标本作最大静水压及顺应性检测，20 mm × 5 mm 组织片作最大抗张力检测。

2结果
2.1管型模具育种
分离培养所得细胞经透射电镜观察、凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色、ET放射免疫法鉴定证实为VEC细胞，并成功育种钛合金管型模具（图4）。

2.2 NBTEBV大体观察
NBTEBV动态培养第7天，取下组织工程血管，血管长57 mm，外径4 mm，壁厚0.4 mm，呈乳白色，质地均匀且具有良好柔韧性及弹性（图5）。

2.3组织工程血管上VEC/VSMC成活和增殖能力
静置孵育24 h，血管上成活细胞相对数（用已知细胞数量的溶液光吸收曲线换算得出）为3.5×105/mg；动态培养7 d后，血管上成活细胞相对数为8.9×106 /mg。

2.4组织学观察
静置孵育24 h后，扫描电镜观察组织工程血管内壁结构，可见MECM呈网状支架结构，网孔直径约600 nm，支架纤维直径约100 nm（图6）。

内皮细胞尚未铺满管壁，呈梭形黏附于纳米级的MECM网状支架上，细胞间较松散，伪足有交叉。

扫描电镜观察组织工程血管外壁结构，可见MECM网状支架内杂有VSMC，细胞有伪足与支架纤维黏附，细胞分泌不明显（图7 a）；HE染色可见MECM是较规则的红染蛋白纤维，其间混杂紫褐色的PLGA纤维，纤维网间散布黑色细胞核（图7 b）。

动态培养7 d，扫描电镜观察组织工程血管内壁结构，可见内皮细胞完全覆盖了组织工程血管内壁，呈典型“铺路石”样，内皮细胞表面有微绒毛（图8）。

扫描电镜观察组织工程血管外壁结构，可见MECM网状支架内大量VSMC增殖并分泌ECM，呈现典型“峰谷”样结构；HE染色可见红染的ECM较静置培养时明显增多，呈现不规则红染蛋白纤维，其中混杂大量紫褐色的PLGA纤维，纤维网间散布黑色细胞核（图9）。

组织工程血管横断面扫描电镜观察可见组织工程血管有酷似天然血管的分层结构，内层为单层内皮细胞，管壁为多层VSMC，周围有丰富的MECM（图10 a） ；HE 染色见VSMC分泌的ECM中混杂紫褐色PLGA纤维（图10 b）。

2.5组织工程血管最大抗张力检测
动态培养第7天组织工程血管最大静水压为950 mmHg，拟生理血压下（110/70 mmHg），管径顺应变化率为3.0%；20 mm × 5 mm组织片最大抗张强度为18.5 MPa。

3讨论
随着血管外科学的发展，血管置换手术量逐年增长，寻找良好的血管替代品一直是各国学者致力的焦点[3-5]。

自Langer等（1993）提出“组织工程”概念以来，运用组织工程技术构建新型血管移植物日益受到瞩目。

理想的组织工程血管应具有与天然动脉相似的结构与功能。

近期对天然血管ECM研究表明，天然血管是一个纳米构造，脱去血管细胞后可见整个支架具有纳米微观结构[6]。

细胞在动物体内生存的微环境大多是由66 nm胶原纤维构成的纳米支架结构，除蛋白质是调节细胞生命活动的重要因素外，纳米级的支架结构界面可能是另一重要因素。

研究表明在纳米级的生物支架材料上，细胞增殖、黏附、分泌等生物学特性明显增强[7]。

故模仿构建ECM，进而构建仿生组织工程血管是2000年以后各国学者研究的热点[8]。

上世纪末期随着纳米技术的发展，人们重新发现了Formhals（1934）发明ELSP的价值，在合适的ELSP参数条件（电压、溶液浓度、电纺距离等）下纺出的纤维可达到纳米级[9]。

近年来，国外学者利用ELSP 技术成功仿制了多种类型器官的ECM，并作为支架材料构建组织工程器官[10-17]，但支架构建和细胞种植不是同步进行的，制作过程繁琐，周期漫长。

有研究表明高压静电场下细胞能维持正常的生理状态[18]。

所以我们的实验尝试了利用ELSP技术同步合成具有MECM 和天然血管三维结构的组织工程血管。

在实验中我们发现合适的电纺参数使VSMC悬液形成泰勒圆锥，具有可纺性，同时注意到细胞喷头与MECM喷头相向喷纺时，不但减少了不同成分电纺丝之间的扰动，保证了MECM纳米拓扑结构，而且使VSMC均匀分布于纳米纤维孔隙中。

实验中用外表面种植了VEC的钛合金管型模具作为接收屏，分别接收相互垂直的细胞喷头和MECM喷头的电纺液，这样同步三维构建组织工程血管成为可能。

为保持细胞活力，电纺仪使用了多排喷头缩短电纺时间，另外钛合金管表面布满了直径20 μm微孔的特殊结构，这样当钛管以250 r/min转动时，在离心力和毛细吸力作用下，管内的DMEM培养液不断渗透至管外，一定程度上保持了管壁上育种的细胞活力。

电纺完成后组织工程血管静置孵育24 h，使模具上VEC向电纺层生长黏附，抽去模具后可使较多的VEC保留在组织工程血管内壁上。

国外文献报道VEC动态培养7～8 d可铺满管壁[19-21]，这与我们实验第7天观察结果相符合。

实验中模仿了天然血管
图1 VEC育种管型模具示意图图2电纺仪组装及工作示意图（为提高电纺效率，实际装置中采用多排喷头）图3生物反应器示意图图4育种VEC的钛管型模具图5 动态培养第7天，NBTEBV标本大体观察图6 静态孵育24 h，NBTEBV内壁扫描电镜观察
（× 1 300）图7静态孵育24 h，NBTEBV管壁外壁观察扫描电镜观察（×1 100）HE染色（×100） 图8 动态培养第7天NBTEBV
内壁扫描电镜观察（×1 300）图9动态培养第7天，NBTEBV管壁外壁观察扫描电镜观察（×500）HE染色（× 100） 图10动态
培养第7天，NBTEBV标本横断面观察扫描电镜观察（×20）HE染色（×100）
Fig.1 Conceptual diagram of VEC cultured on Ti tube tooting Fig.2 Conceptual diagram of ELSP configuration and working（multi-row nozzle used to improve efficiency of ELSP in actual experiment）Fig.3 Conceptual diagram of bioreactor Fig.4 Ti tube tooting cultured with VEC Fig.5 Specimen of NBTEBV in dynamic culture with bioreactor in vitro for 7 days Fig.6 SEM of NBTEBV inner wall in static culture for 24 hours (×1 300) Fig.7 NBTEBV inner wall in static culture for 24 hours Result of SEM（×1 100）Result of HE
staining（× 100）Fig.8 SEM of NBTEBV inner wall in dynamic culture with bioreactor for 7 days（×1 300）Fig.9 NBTEBV inner wall in dynamic culture with bioreactor for 7 days Result of SEM（×500）Result of HE staining（×100）Fig.10 NBTEBV
cross section in dynamic culture with bioreactor for 7 days Result of SEM（×20）Result of HE staining（×100）
ECM的蛋白成分，用ELSP技术模拟了天然血管ECM 的纳米空间结构，由于种子细胞和支架材料同步三维构建，对于蛋白成分的交联处理受到限制[22]，所以可降解材料PLGA的加入增加了纳米纤维的强度。

在纳米级网状MECM支架上，细胞表现出良好的黏附、增殖、分泌等生物特性，同时细胞本身也改建其周围的基质环境，这样构建的血管其生物学特性更近似于天然血管。

实验构建的组织工程血管不但外观酷似天然血管，而且能耐受的静水压远远超过生理血压，其管壁的弹性和顺应性与天然血管相近。

对该血管的组织相容性、体内降解周期以及生物重塑演化过程，正在后续相关实验中进行。

我们的实验中以同体血管内皮细胞和平滑肌细胞作为种子细胞，而成体细胞体外扩增的量有一定限制，因此对于长段的NBTEBV构建，种子细胞的来源有待进一步改进。

干细胞作为良好的种子细胞来源，近年来有较多的报道[23-24]，在后继的研究中我们正考虑以同体MSCs作为种子细胞体外诱导分化、繁殖扩增的来源。

我们实验应用纳米技术首次将种子细胞种植、生物支架构建及组织工程血管三维构建同步完成，简化了原来繁琐的构建过程。

这对于急需血管替代品的临床治疗是有积极意义的。

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 （收稿：2007-04-23 二次修回：2007-07-30）
（本文编辑：王雁董奇男）。