南京农业大徐细胞生物学kj3
南农 细胞生物学 讲义背诵
细胞生物学第一章绪论•细胞是生命体的结构与生命活动的基本单位•细胞的研究是生命科学的基础和重要支柱一、显微镜的发明与细胞的发现没有显微镜，就不可能有细胞生物学的诞生1、1590年荷兰眼镜制造商J和Z.Janssen制作了第一台复式显微镜。
2、1665年Robert Hook（虎克）第一次描述了植物细胞的构造，并首次用拉丁文celler 来称呼他所看到的蜂巢状的封闭状小室。
3、1680年荷兰人Anton van Leeuwenhoek（列文虎克）成为皇家学会会员，他一生制作了200多台显微镜和400多个镜片，并利用设计好的显微镜观察了许多动植物的活细胞和原生动物。
二、细胞学说三、细胞生物学的定义(cell biology)•细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它在不同层次(显微、亚显微与分子水平)上以研究细胞结构与功能，细胞增殖、分化、衰老与凋亡，细胞信号传递，真核细胞基因表达与调控，细胞起源与进化等为主要内容。
•细胞生物学是应用现代物理学与化学的技术成就和分子生物学的概念与方法，以细胞作为生命活动的基本单位的思想为出发点，探索生命活动规律的学科。
四、细胞生物学的地位•细胞生物学与农业、医学、生物高技术发展有着密不可分的关系。
•细胞生物学、分子生物学、神经生物学和生态学并列为生命科学的四大基础学科。
•细胞分子生物学是当今细胞生物学的重点五、细胞生物学的主要研究内容•细胞结构功能•细胞重要生命活动(一)细胞核、染色体以及基因表达的研究(二)生物膜与细胞器的研究(三)细胞骨架体系的研究(四)细胞增殖和调控(五)细胞分化及其调控(六)细胞的衰老与凋亡(七)细胞的起源与进化(八)细胞工程六、细胞生物学研究的总趋势与重点领域总的发展趋势:细胞生物学与分子生物学相互渗透与交融。
(一)当前细胞生物学研究中的三大基本问题1 细胞内的基因组(人类大约有10万个基因)是如何在时间与空间上有序表达的?2 基因表达的产物--主要是结构蛋白与核酸、脂质、多糖及其复合物，它们如何逐级装配成能行使生命活动的基本结构体系及各种细胞器?这种自组装过程的调控程序与调控机制是什么?3 基因表达的产物--主要是大量活性因子与信号分子，它们是如何调节细胞最重要的生命活动过程的?诸如细胞的增殖、分化、衰老与凋亡等等(二)当前细胞基本生命活动研究的若干重大课题1．染色体DNA与蛋白质相互作用关系--主要是非组蛋白对基因组的作用2．细胞增殖、分化、凋亡(编程性死亡)的相互关系及其调控3．细胞信号转导的研究4．细胞结构体系的装配全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是：•细胞信号转导(signal transduction)•细胞凋亡(cellapoptosis )•基因组与后基因组学研究(genome and post-genomic analysis)。
细胞生物学排名排名
细胞生物学全国排名
B+ 等 (20 个 ) ：兰州大学、中国农业大学、中国海洋大学、中南大学、中山大学、东北林业大学、首都医科大学、复旦大学、南京林业大学、吉林大学、河北师范大学、华中科技大学、辽宁师范大学、中国医科大学、湖南农业大学、山东师范大学、华中农业大学、南方医科大学、南京师范大学、福建农林大学
B 等 (20 个 ) ：南京医科大学、华东师范大学、湖南师范大学、西北大学、西南大学、西安交通大学、郑州大学、深圳大学、首都师范大学、苏州大学、重庆医科大学、河南大学、安徽师范大学、陕西师范大学、华南师范大学、四川农业大学、河南师范大学、四川师范大学、安徽医科大学、扬州大学
C 等 (14 个 ) ：名单略。
南农 细胞生物学 9
2．染色体分离
后期A和后期B两个阶段假说。 在后期A，动粒微管变短，将染色体逐渐拉向两极。动粒
微管变短是由于其动粒端解聚所造成的； 在后期B，极性微管蛋白聚合，使极性微管加长，形成较
宽的极性微管重叠区。重叠区相互滑动，逐渐变得狭 窄， 两极之间的距离逐渐变长。
三、 减数分裂 (premeioticinterphase)。
移动，并参与装配纺锤体。 到细胞分裂结束，两个子细胞分离，每个子细胞获得一
个中心体。
2．动粒与着丝粒
动粒(kinetochore)又称 为着丝点，是附着于着丝 粒上的，合称为着丝粒— 动粒复合体 (centromere— kinetochorecomplex)。
每条中期染色体上含有两 个动粒，分别位于着丝粒 的两侧。
二、有丝分裂
划分为前期、前中期、中期、后期、末期和胞质分裂等6 个时期。
前5个时期是一个先后相互连续的过程，胞质分裂则相对 独立。
(一)有丝分裂过程
1．前期(prophase)
细胞核染色质开始浓缩(condensation)，由线性染色质， 逐渐变短变粗，形成光镜下可辨的两条染色单体
在着丝粒处逐渐装配动粒(kinetochore) ,动粒和着丝粒 紧密相连。
周期中细胞转化为Go期细胞多发生在G1期。 Go期细胞一 旦得到信号指使，会快速返回细胞周期
(二)细胞1期
G1期是一个细胞周期的第一阶段 G1期细胞开始合成生长所需要的各种蛋白质、糖类、脂
质等，但不合成DNA 在Gl期的晚期阶段有一个特定时期称为限制点
要进行染色体配对和基因重组。合成一定量的 RNA和蛋白质。
根据细胞形态变化，又可以将前期I人为地划分 为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期等 5个阶段。
南农 细胞生物学 10
第十二章细胞分化与基因表达调控特异性蛋白质合成的实质在于基因选择性表达。
正因为如此，本章的主题才定为细胞分化与基因表达调表12几种生物的细胞数目与类型细胞类型在个体正常发育过程中，通过有控制的细胞分裂而增加细胞数目，通过有序的细胞分化而增加细胞类型，进而由不同类型的细胞构成生物体的组织与器官，执行不同的功能。
显然，细胞分化为某种细胞类群通过相互协同作用完成各种复杂特殊的生物学功能，为生命向更高层次的发展与进化奠定了基础。
尽管分化的细胞类型千差万别，但究其本质却是基因组保持相同而表达的基因有所不同，从而在形态结构、生理功能及生物学行为方面均有所不同。
细胞分化过程常常伴随着细胞增殖与细胞凋亡，分化细胞的最终归宿往往是细胞的衰老和死亡。
细胞癌变是细胞分化领域中的一个特殊问题，因为肿瘤细胞可以看做是正常细胞分化机制失控的细胞，成为不衰老的永生细胞，丧失分化细胞的正常生理功能，形态上趋于一致，表现出某些未分化细胞的特征(有人称之为“去分化”)。
然而肿瘤细胞的基因组却不同程度地发生了改变，其结果是正常机体的构建受到破坏，并丧失了相应的正常生物学功能。
第一节细胞分化一、细胞分化的基本概念(一)细胞分化是基因选择性表达的结果早期人们推测细胞分化是由于细胞在发育过程中遗传物质的选择性丢失所致。
现代分子生物学的证据表明，细胞分化是由于基因选择性的表达各自特有的专一性蛋白质而导致细胞形态、结构与功能的差异。
如鸡的输卵管细胞合成卵清蛋白，成红细胞合成β珠蛋白，胰岛细胞合成胰岛素，这些细胞都是在个体发育过程中逐渐产生的。
用编码上述三种蛋白的基因分别作探针，对三种细胞中提取的总DNA的限制性酶切片段进行Southern杂交实验。
结果显示，上述三种细胞的基因组DNA中均存在卵清蛋白基因、 β珠蛋白基因和胰岛素基因 (表12—2)；然而用同样的三种基因片段作探针，对上述三种细胞中提取的总 RNA进行Northern杂交实验，结果表明，仅在输卵管细胞中表达卵清蛋白 mRNA，而成红细胞中表达β珠蛋白mRNA，胰岛细胞中表达胰岛素mRNA(表表12—2 ) 上述结果说明，不同类型的细胞在发育过程中表达一套特异的基因，其产物不仅决定细胞的形态结构，而且执行各自的生理功能。
(整理)南农细胞生物学6.
第八章细胞核与染色体细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传与代谢的调控中心。
自1831年R．Brown首次命名细胞核(nucleus)以来，对于细胞核的研究始终倍受重视。
所有真核细胞，除高等植物韧皮部成熟的筛管和哺乳动物成熟的红细胞等极少数例外，都含有细胞核。
一般说来，真核细胞失去细胞核后不久即导致细胞胞核直径一般为5～20 μm，低等植物细胞核直径约1—4μm。
细胞核主要由核被膜、染色质、核仁及核骨架组成(图8—1)。
细胞核是遗传信息的贮存场所，在这里进行基因复制、转录和转录初产物的加工过程，从而控制细胞的遗传与代谢活动。
第一节核被膜与核孔复合体核被膜(nuclear envelope)位于间期细胞核的最外层，是细胞核与细胞质之间的界膜。
由于它的特殊位置决定了它有两方面的功能，一方面核被膜构成了核、质之间的天然选择性屏障，它将细胞分成核与质两大结构与功能区域：DNA复制、RNA转录与加工在核内进行，蛋白质翻译则局限在细胞质中。
这样就避免了彼此相互干扰，使细胞的生命活动更加秩序井然；同时核被膜还能保护核内的DNA分子免受由于细胞骨架运动所产生的机械力的损伤。
另一方面，核被膜并不是完全封闭的，核质之间有频繁的物质交换与信息交流，这主要是通过核被膜上的核孔复合体进行的。
核被膜在普通光学显微镜下难以分辨，在相差显微镜下，由于细胞核与细胞质的折光率不同，可以看出核被膜的界限，只有在电子显微镜下才能看清核被膜的细微结构。
关于核被膜的结构组成，目前有两种看法，一种意见认为核被膜有三种结构组分，即双层核膜、核孔复合体与核纤层(图8—1)。
核纤层(nuclear lamina)紧贴内层核膜下，是一层由纤维蛋白构成的网络结构，它与胞质中间纤维、核内骨架有密切联系。
当真核细胞用非离子去垢剂、核酸酶及高盐溶液等分级抽提后，核纤层往往与核孔复合体、胞质中间纤维、核内骨架一起被保存下来，成为贯穿于细胞核与细胞质的骨架结构体系；由此又有人认为核纤层不应该属于核被膜的一种结构组分。
南农 细胞生物学 10
第十三章 细胞衰老与凋亡
2020/8/13
早期的细胞衰老研究
• 100年前，关于原生动物不死的说法广为流行 。
• 20世纪40—50又使细胞“不死性”的观点的统 治地位更加巩固了。
• 在60年代初，Hayflick等人的工作从根本上动 摇了细胞“不死性”的观点。
2020/8/13
• 全能性的细胞举例 o 受精卵 o 早期的胚胎细胞。 o 植物的体细胞
2020/8/13
细胞多潜能性(pluripotency)
• 随着胚胎的发育，动物细胞特别是高等 动物细胞逐渐丧失了发育成个体的能力 ，仅具有分化成有限细胞类型及构建组 织的潜能，这种潜能称为多潜能性。
2020/8/13
干细胞(stem cell)
• 恶性肿瘤(malignancy) 具有转移能力的肿瘤
•癌 ✓ 对上皮组织的恶性肿瘤的习惯名称 ✓ 目前作为恶性肿瘤细胞的通用名称。 • 基因突变招致细胞的生长与分裂失控，脱离了衰
老和死亡的正常途径而成为癌细胞(cancer cell) 。
2020/8/13
癌细胞的基本特征
• 1．细胞生长与分裂失去控制 • 2．具有侵润性和扩散性 • 3．细胞间相互作用改变 • 4．蛋白表达谱系或蛋白活性改变 • 5．mRNA转录谱系的改变
• 1．胞外信号分子的影响 • 2．细胞记忆的影响 • 3．细胞质的不均一性的影响 • 4．细胞间的相互作用与位置效应
2020/8/13
1．胞外信号分子的影响
• 近端组织的相互作用 一部分细胞会影响周围细胞使其向一定方 向分化。
✓旁分泌。 • 细胞间远距离相互作用 ✓通过激素来调节 ✓蝌蚪变态过程
• 衰老是不可避免的，衰老的原因在于细胞本身
南农 细胞生物学 4
第六章细胞质基质与细胞内膜系统在光学显微镜下，生活的真核细胞的细胞质内几乎看不到什么结构。
电镜出现后，人们发现，真核细胞的细胞质内具有发达的内膜系统(endomembrane很多学者特别是生物化学家曾一度把细胞质基质看成是酶的溶液。
然而，无论从结构还是功能上看，细胞质基质都不是简单的酶溶液，越来越多的证据表明，细胞质基质很可能是高度有组织的体系。
由于细胞质基质的独特结构特征,研究难度较大，以至于现在还没有一个确切而统一的概念。
在研究细胞质基质过程中，曾赋予它诸如细胞液 (cellsap)、透明质(hyaloplasm)、胞质溶胶(cytos01)、细胞质基质等,目前常用的名称是细胞质基质和胞质溶胶，二者虽有差异但常常等同使用。
和细胞内物质运输有关的细胞质骨架结构。
在细胞质基质中蛋白质含量约占20％～30％，形成一种粘稠的胶体，多数的水分子是以水化物的形式紧密地结合在蛋白质和其他大分子表面的极性部位，只有部分水分子以游离态存在，起溶剂作用。
细胞质基质中蛋白质分子和颗粒性物质的扩散速率仅为水溶液中的1／5，更大的结构如分泌泡和细胞器等则固定在细胞质基质的某些部位上，或沿细胞骨架定向运动。
人们推测，细胞质基质是一个高度有序的体系。
因为在细胞质基质中，各种代谢活动高效有序地进行，物质、能量与信息的定向转移和传递协调有序，这些复杂的生命过程都不是简单的“酶溶液”所能完成的。
在细胞质基质中，细胞质骨架纤维贯穿在粘稠的蛋白质胶体中，多数的蛋白质直接或间接地与骨架结合，或与生物膜结合，从而完成特定的生物学功能。
比如，与酵解有关的酶类，彼此之间可能以弱键结合在一起，形成多酶复合体，定位在细胞质基质的特定部位，催化从葡萄糖至丙酮酸的一系列反应。
前一个反应的产物即为下一个反应的底物，二者间的空间距离仅为几个纳米，在细胞质基质中，大分子之间都是通过弱键而相互作用的，并且常常处于动态平衡之中。
这种结构体系的维持只能在高浓度的蛋白质及其特定的离子环境的条件下实现。
南农 细胞生物学 5
第七章细胞的能量转换---线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体是细胞内的两种产能细胞器。
叶绿体通过光合作用把光能转换为化学能，并储存于糖类、脂肪和蛋白质等大分子有机物中。
线粒体是一种高效地将有机物转换为细胞生命活动的直接能源ATP的细胞器。
线粒体普遍存在于各类真核细胞中，而叶绿体仅存在于植物细胞中。
它们的形态特征主要是封闭的双层单位膜结构，且内膜经过折叠并演化为表面积极大扩增的内膜特化结构系统。
内膜在能量转换功能中起着主要作用。
大量扩增的内膜不仅为线粒体的氧化磷酸化和叶绿体的光合磷酸化反应提供了结构框架。
线粒体和叶绿体有着相似的基本结构，而且以类似的方式合成ATP。
线粒体和叶绿体都是半自主性的细胞器。
线粒体和叶绿体都具有环状DNA及自身转录RNA与翻译蛋白质的体系。
很多学者把线粒体和叶绿体的遗传信息系统称为真核细胞的第二遗传信息系统，或称核外基因及其表达体系。
第一节线粒体与氧化磷酸化线粒体被称为细胞内的“能量工厂”(power plants)。
线粒体通过氧化磷酸化作用合成ATP,为细胞提供能量。
人体内的细胞每天要合成几千克的ATP，且95％的ATP是由线粒体中的呼吸链所产生，一、线粒体的形态结构(一)线粒体的形态、大小、数量和分布线粒体的形态、大小、数量与分布，在不同细胞内变动很大，就是同一细胞,在不同生理状态下也不一样。
许多哺乳动物成熟的红细胞缺少线粒体；线粒体具有多形性、易变性、运动性和适应性。
其形状以线状和颗粒状最常见，也可呈环形、哑铃形、枝状或其他形状。
在一定条件下线粒体的形状变化是可逆的。
线粒体一般直径为0.5—1.0μm，长1.5～3.0μm。
线粒体的数目与细胞的生理功能及生理状态有关，在新陈代谢旺盛的细胞中线粒体多，如人和哺乳动物的心肌、小肠、肝等内脏细胞中线粒体很丰富；飞翔鸟类胸肌细胞线粒体的数目比不飞翔鸟类的多；运动员的肌细胞线粒体比不常运动的人的多。
线粒体在细胞内的分布一般是不均匀的，例如，肠上皮细胞中的线粒体呈两极性分布，集中于顶部和基部。
南京农业大学细胞生物学专业考研
南京农业大学细胞生物学专业考研细胞生物学是研究细胞生命活动基本规律的科学，它是生命科学领域的一级学科，在我校于2000年开始招生。
近年来由于分子生物学的飞速发展，细胞生物学正越来越多地采用分子生物学的方法和思路在分子水平上探讨细胞生命活动的基本机理。
本学科主要的研究方向和指导教师如下：叶绿体的分子细胞生物学：探讨叶绿体内关键酶和蛋白复合体的组装与折叠，指导教师陆巍副教授。
植物细胞的衰老与调控：主要探讨叶绿体光合机构的衰变过程及其相应的细胞学和分子生物学原理，指导教师戴新宾副教授。
植物细胞活性氧的信号转导及植物细胞对逆境响应的分子机制：主要涉及细胞内ABA、活性氧的积累及其诱导抗氧化防护的信号转导机制，指导教师蒋明义教授。
植物细胞对逆境的响应：研究逆境条件下植物细胞的反应机制，指导教师沈振国教授。
植物胚胎发生的分子细胞生物学：研究植物胚胎发育过程中细胞形态和结构的变化，指导教师杨清教授。
植物细胞工程：植物细胞的培养，植株的再生，细胞显微操作，细胞的融合等，指导教师杨清教授。
动物粘膜免疫，指导教师杨倩教授。
目前学科在研科研项目有国家973、国家自然科学基金、省部级等课题10余项，研究经费200余万元。
主要研究人员年富力强。
教授4名、副教授3名，均具有博士学位。
本专业近年来合计发表SCI 收录论文20余篇。
小提示：目前本科生就业市场竞争激烈，就业主体是研究生，在如今考研竞争日渐激烈的情况下，我们想要不在考研大军中变成分母，我们需要：早开始+好计划+正确的复习思路+好的辅导班（如果经济条件允许的情况下）。
2017考研开始准备复习啦，早起的鸟儿有虫吃，一分耕耘一分收获。
加油！。
南农细胞生物学7详解
南农细胞生物学7详解第九章核糖体第一节核糖体的类型与结构核糖体是合成蛋白质的细胞器，其唯一的功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且精确地合成多肽链。
1953年，Robinsin和Brown 用电镜观察植物细胞时发现了这种颗粒结构。
1955年Palade在动物细胞中也观察到类似的结构。
1958年Roberts建议把这种颗粒结构命名为核糖核蛋白体(ribosome)，简称核蛋白体或核糖体。
核糖体几乎存在于一切细胞内，不论是原核细胞还是真核细胞，均含有大量的核糖体。
即使最小最简单的细胞支原体，也至少含有数以百计的核糖体。
线粒体和叶绿体中也含有核糖体。
目前，仅发现在哺乳动物成熟的红细胞等极个别高度分化的细胞内没有核糖体。
因此可以说核糖体是细胞最基本的不可缺少的结构。
核糖体是一种颗粒状的结构，没有被膜包裹，其直径为25 nm，主要成分是蛋白质与RNA。
核糖体RNA称为rRNA，蛋白质称r蛋白，蛋白质含量约占 40％，RNA约占60％。
r蛋白分子主要分布在核糖体的表面，而rRNA则位于内部，二者靠非共价键结合在一起。
在真核细胞中很多核糖体附着在内质网的膜表面，称为附着核糖体，它与内质网形成复合细胞器，即糙面内质网。
在原核细胞的质膜内侧也常有附着核糖体。
还有一些核糖体不附着在膜上，而呈游离状态，分布在细胞质基质内，称游离核糖体。
附着核糖体与游离核糖体所合成的蛋白质种类不同，但核糖体的结构与化学组成是完全相同的。
核糖体常常分布在细胞内蛋白质合成旺盛的区域，其数量与蛋白质合成程度有关。
处在指数生长期的细菌中，每个细胞内大约有数以万计的核糖体，其含量可达细胞干重的40％。
而在培养的饥饿状态的细胞内，仅有几百个核糖体。
在体外培养的HeLa细胞中，核糖体的数目约为5X106～1X107个。
从核糖体发现至今近50年的时间，对核糖体的结构、成分与功能的研究，积累了丰富的材料，特别是近几年对rRNA的研究取得了重要的进展。
精细的生物化学分析，分子生物学、免疫学及其与电子显微镜技术的配合是取得这些成果的重要实验基础。
南农-细胞生物学-11
南农-细胞生物学-11第十三章细胞衰老-5凋亡第一节细胞衰老早期的细胞衰老研究关于细胞衰老(cellular aging或cell senescence)的研究，在衰老生物学中占有特殊的地位。
大量研究表明，衰老实际上也是一种细胞的重要生命活动。
然而对这一问题的认识过程却是漫长而曲折的。
大约在100年前，当魏斯曼提出种质不死而体质会衰老和死亡的学说时，他是将单细胞生物，特别是原生动物排除在外的。
确实，当时观察到原生动物的某些无性系可以长期保持很高的分裂速度，因此关于原生动物不死的说法曾经广为流行。
但以后的研究却发现原生动物的细胞分裂不是均等的，新细胞的结构成分并不是完全更新的，新细胞中也存在着老化的结构成分；少数强壮的无性系的存在并不能否定原生动物细胞衰老的事实。
因此关于原生动物细胞“不死性”的说法就逐渐被废弃了，代之而起的是关于某些无性系的稳定性的观点。
然而，当Carrel和Ebeling宣布他们培养的鸡心脏细胞可以无限制地生长和分裂(直到他们报告时，已连续培养了34年)时，细胞“不死性”的观点不但卷土重来，而且几乎取得了决定性的胜利。
后来他们还报告说，鸡胚成纤维细胞在离体培养条件下的生长速度与培养基中加入的鸡血浆供体年龄呈负相关，似乎表明年老动物的血浆中存在有衰老因子。
他们认为细胞本身不会衰老，衰老是由于环境的影响。
20世纪40—50年代L系小鼠细胞和HeLa细胞系的建立，又使细胞“不死性”的观点的统治地位更加巩固了。
根据这种观点，细胞本身没有衰老和死亡，衰老只是一种多细胞现象，多细胞生物体内观察到的细胞衰老，起因不在细胞本身，而是由于体内、体外环境的影响。
这种观点在60年代初，主要由于Hayflick等人的工作而受到猛烈的冲击，并从根本上动摇了。
二、Hayflkk界限1961年，Hayflick和Moorhead报告说，培养的人二倍体细胞表现出明显的衰老、退化和死亡的过程。
若以1：2的比率连续进行传代(群体倍增)，则平均不能重复出Carrel所观察到的培养细胞无限生长的现象。
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第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
用超速离心技术分离细胞器与 生物大分子及其复合物
差速离心(differential centrifugation) 沉降系数S与大小和形状有关 密度梯度离心
TEM
0.1nm
电磁透镜
要求真空 1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子的散射和 透射形成明暗反差
超薄切片技术Ultrathin section
制样要求：样品很薄；完好保持其精细结构， 40-50 nm，即d为20 m细胞可切几百片，需 刚性、韧性 固定：OsO4、戊二醛、KMnO4、高频微波(低 温、快速、样块不宜太大) 包埋：完整、耐干燥、电子轰击和真空挥发， 环氧树脂(包埋剂要求) 切片 染色：锇酸染脂肪，铅盐染蛋白质，醋酸铀 染核酸
– – – – – 多种成分定位 只有激发荧光可成像，敏感度高 染色简便 标本呈彩色图像 固定细胞和活细胞
数字成像显微技术
图像后期处理，提高信/噪比、放大信号
摄像机和计算机
原理：摄取同一区域多幅图像，信号经 计算机放大、假信号减弱或消除
暗场显微技术
明视野局限性
– 具颜色，吸收或折射随机光
光镜水平的原位杂交技术 in situ hybridization
（同位素标记或荧光素标记的探针）
电镜水平的原位杂交技术
（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）
分子水平的原位杂交技术
(PCR技术)
BACK
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
放射自显影技术：利用放射性同位素电离 辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大 分子进行定性定位与半定量研究的技术 追踪 DNA：3H-TdR RNA： 3H-U 蛋白质：35S 标记Met和 Cys，3H 或14C标 记Met和Leu等
1981年，IBM苏黎世实验室的Binnig，Rohrer， Gerber和Weible发明的，探测微观世界物质表面 形貌的仪器
统称扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope, SPM):包括STM、AFM (atomic force microscope)、 磁力显微镜、摩擦力显微镜等
电镜三维重构技术
电子显微镜技术、电子衍射与计算机图像处理 相结合，适于难形成三维晶体膜蛋白、病毒和 蛋白质-核酸复合物三维结构 A.Klug 技术，一系列电镜照片经傅里叶变换得 到大分子电子密度图 低温电镜技术(cryoelectron microscopy)：直接 冰膜包埋，在-160°C制样台利用相位衬度成 像 电镜三维重构技术与X射线晶体及核磁共振技 术，当前结构生物学主要实验手段
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
步骤
– – – – – 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 常规制片 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) 暗盒暴光或自显影 显影、定影、观察
与显微自显影区别
敷胶要单层晶体 暴光时间长
定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry)
电子显微镜技术
电子显微镜的基本知识
– 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 – 电子显微镜的分辨率与有效放大倍数 – 电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术介绍
– – – – – 超薄切片技术 负染色技术 冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术 电镜三维重构技术 扫描电镜技术
BACK
电子显微镜与光学显微镜的基本区别
电子显微镜的基本构造
电子束照明系统
– 电子枪、聚光镜
成像系统
– 物镜、中间镜与投影镜
真空系统
– 电子枪、镜筒及记录系统
记录系统
– 荧光屏、感光胶片
电 镜 与 光 镜 光 路 图 比 较
电镜与光镜的比较
显微镜 LM 分辨本领 200nm 100nm 光源 可见光 （400-700） 紫外光 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） 透镜 玻璃透镜 玻璃透镜 真空 不要求真空 不要求真空 成像原理 利用样品对光的吸收形成 明暗反差和颜色变化
微分干涉(differential-interference)显微镜技术
原理
平面偏振光经棱镜折射分成两束，不同时 间经过样品的相邻部位，再经另一棱镜汇合， 使样品厚度的微小差别转换成明暗区别
优点 增加样品反差和立体感 可观察活细胞中较大细胞器 与录象机连接，活细胞中颗粒及细胞器运动 用计算机辅助，更精细结构
暗场
– – – – 通过样品进入成像系统的仅折射光或衍射光 微生物计数 放射自显影的银颗粒观察 分辨率低
激光共焦扫描显微镜技术 (Laser Scanning Confocal Microscopy)
原理： 排除焦平面以外光的干扰，增强
图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构 样品的三维结构
荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy)
原理与应用
直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质
等生物大分子的定性定位
如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy)
原理：以紫外线为光源，照射被检测物体发出 荧光后，在显微镜下观察其形状及位置仪器 自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基 绿、吖啶橙) 优点：
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细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂 质等的显示方法
DNA：Feulgen反应，酸除去RNA和DNA上的 嘌呤脱氧核苷酸，使其醛基暴露，自由醛基再 通过Schiff试剂反应呈紫红色 多糖：PAS反应，同上原理使希夫试剂与醛基 反应，但多糖先被过碘酸氧化 脂肪：四氧化锇，苏丹III，苏丹黑 蛋白质：Millon反应，氮汞试剂与蛋白质侧链 酪氨酸残基反应，成红色沉淀；重氮反应中， 氢氧化重氮与Tyr，Ser和His反应成有色复合物
0.2 m 电子显微镜技术(Electro microscopy) 0.2nm 扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope) 3nm, 0.7nm 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microsc第三章 细胞生物学研究方法
概论
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法
细胞培养、细胞工程与显微操作技术
概论
对实验技术的依赖性 显微镜细胞学，奠基性作用 电镜与生物化学及分子生物学结合 细胞生物学，决定性作用
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第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术(light microscopy）
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特异蛋白质抗原的定位与定性
免疫酶标记技术，酶代替荧光素与抗体偶联 免疫电镜技术 免疫铁蛋白技术：淘汰状态 免疫酶标技术： 免疫胶体金技术：易识别、高分辨率、多 重标记、超薄切片、装配成分
应用：分泌蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的 定位与骨架蛋白的定位等
细胞内特异核酸的定位与定性
扫描电镜Scanning electron microscope
电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次 电子，探测器收集、转换、放大二次电子成 象 CO 2 临界点干燥法，解决引起样品变形的表 面张力问题 景深长，具强烈立体感 不能观察活样品和细胞全貌
扫描隧道显微镜 Scanning tunneling microscope
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扫描遂道显微镜原理
量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电 极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠) 当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电 流(隧道电流)，且Iexp(-2Kd)，d为针尖与样品 间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定
扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产 生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从 而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
负染色技术negative staining
生物大分子(病毒、线粒体基粒、 核糖体、蛋白纤维)精细结构 分辨率：1.5 nm 磷钨酸或醋酸双氧铀 机理：未知
Examples of negtively stained and metalshadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).
利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，
测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞
内的含量 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法
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定量细胞化学分析技术
流式细胞仪(Flow Cytometry)
扫描遂道显微镜
特点
(1)对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，具高分辨(侧分 辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率达0.01nm)
(2) 得到三维图象，可测量厚度信息 (3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性 (4)可连续成像，进行动态观察
用途
DNA、RNA、蛋白质、病毒等生物大分子结构；纳米生物 学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的 结构
冷冻断裂(fracturing)和冷冻蚀刻(etching)电镜 技术
原理：快速低温冷冻使样品从结构相对“脆弱” 部位 (磷脂双分子层疏水端)断裂，显示镶嵌在 脂膜中的蛋白质颗粒，冰在真空升华，可增强 “浮雕”式蚀刻效果 膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面，富立体感， 不需包埋，固定，很好保持真实性 冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching)： 细胞骨架纤维及结合蛋白