限制性内切酶酶切位点保护碱基
酶切位点保护碱基表
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，Eco RI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，Pa cI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260位的寡核苷酸。
酶切位点保护碱基表
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A2单位的寡核苷酸。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看)
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 µg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260单位的寡核苷酸。
取1 Q已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20° C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6）, 10 mM MgCI 2 , 5 mM DTT 及适量的NaCl 或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE （7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2. 双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara 公司从1979 年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
保护碱基
保护碱基
限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
添加原则
1、添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
2、添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，
添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
3、添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC
含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
附表一、靠近PCR片段末端识别位点的酶切效率（Fermentas）
当识别位点靠近DNA分子末端时，有些限制酶的酶切效率非常低。
表列出了Fermentas 公司限制酶的识别位点靠近PCR片段末端不同碱基数的切割效率。
（酶切时间为16小时）
2、保护碱基列表（BioLabs）。
限制性内切酶酶切位点保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A
260
核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别
, 反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl
2
5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看)
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
关于保护碱基
关于保护碱基1.首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA 作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
2.添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
因此在设计PCR引物时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
3.添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看酶切位点的保护碱基引物设计在分子生物学领域中起着至关重要的作用。
它们是研究者在酶切实验中必不可少的工具，用于保护酶切位点周围的碱基，以避免酶的切割作用。
本文将介绍保护碱基引物设计的一般原则和具体步骤，并探讨一些常见的问题和注意事项。
保护碱基引物设计的一般原则如下：1.引物长度：保护碱基引物的长度通常为15-25个碱基对。
2.引物序列：引物应根据酶切位点的序列设计。
为了确保引物的特异性，通常将酶切位点和其周围的碱基考虑在内。
3.引物组成：引物的核苷酸组成应考虑碱基的GC含量，以保持引物的稳定性。
通常，GC含量高于50%的引物更稳定。
4.引物末端修饰：引物的末端修饰可以提高引物与目标DNA的亲和性，并增加引物的稳定性。
常用的末端修饰包括磷酸化和胺基修饰等。
保护碱基引物设计的步骤如下：1.获取酶切位点序列：首先，需要获取目标DNA序列中待保护的酶切位点的序列。
2.引物设计：根据酶切位点的序列设计引物。
引物的长度通常为15-25个碱基对。
为了提高特异性，可以考虑在引物序列中加入一些限制性内切酶无法识别的碱基。
3.引物末端修饰：根据需要选择引物的末端修饰方式，例如磷酸化和胺基修饰等。
4.引物的合成：完成引物设计后，可以委托专业的生物科技公司进行引物的合成。
确保引物的纯度和质量。
在进行保护碱基引物设计时，还需注意一些常见的问题和注意事项：1.引物特异性：在设计引物时，要确保引物与目标DNA的序列具有高度特异性，以避免引物与非目标区域的杂交。
2.引物的稳定性：引物的稳定性对于酶切实验的成功至关重要。
在设计引物时，要尽量选择稳定的引物序列，例如具有较高GC含量的引物。
3.引物纯度和质量：为了保证引物的质量和稳定性，引物的合成必须由专业的生物科技公司进行。
确保引物的纯度高，无杂质。
4.引物的浓度和稀释：在使用引物进行酶切实验时，要合理确定引物的浓度和稀释倍数，以保证实验的成功。
总之，保护碱基引物设计是分子生物学研究中不可或缺的一部分。
常用酶切位点序列和保护碱基
常用酶切位点序列和保护碱基引言在分子生物学和遗传工程领域，酶切位点序列和保护碱基是非常重要的概念。
酶切位点序列指的是DNA或RNA上特定的核苷酸序列，这些序列可以被特定的酶识别并切割。
保护碱基则是指在实验过程中采取措施来保护DNA或RNA上特定的核苷酸，使其不被酶切割。
本文将对常用的酶切位点序列和保护碱基进行详细介绍，包括其定义、常见的酶切位点序列、如何选择合适的保护碱基等内容。
酶切位点序列定义酶切位点序列是指DNA或RNA分子上具有一定规律性、可以被特定的限制性内切酶识别并结合从而发挥催化作用的核苷酸序列。
这些限制性内切酶通常能够识别4-8个核苷酸，并在识别到相应的位点后将DNA或RNA分子切割成片段。
常见的酶切位点序列1.EcoRI: 5’-GAATTC-3’，3’-CTTAAG-5’2.HindIII: 5’-AAGCTT-3’，3’-TTCGAA-5’3.BamHI: 5’-GGATCC-3’，3’-CCTAGG-5’4.XhoI: 5’-CTCGAG-3’，3’-GAGCTC-5’5.NotI: 5’-GCGGCCGC-3’，3’-CGCCGGCG-5’这些酶切位点序列是常用的限制性内切酶的识别序列，它们在分子生物学实验中被广泛应用。
通过将DNA或RNA与特定的限制性内切酶一起反应，可以实现DNA或RNA的特定部位切割。
保护碱基定义保护碱基是指在实验过程中采取措施来保护DNA或RNA上特定的核苷酸，使其不被酶切割。
这种保护通常通过对特定的碱基进行修饰或使用化学试剂来实现。
如何选择合适的保护碱基选择合适的保护碱基需要考虑以下几个因素： 1. 酶切位点序列：首先要了解所使用的限制性内切酶的酶切位点序列，以确定需要保护的碱基。
2. 保护方法：根据实验需求和实验条件选择合适的保护方法。
常见的保护方法包括使用化学修饰剂修饰碱基、使用特殊的核苷酸引物或引入特定的修饰基团等。
3. 保护效果：选择的保护碱基应能够有效地阻止限制性内切酶与目标位点结合并发挥催化作用。
酶切位点保护碱基
本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A26单位的寡核苷酸。
取1µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在2 00°C条件下分别反应2小时和20小时。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶切位点是指酶在DNA或RNA分子中特定的位置识别并切割的区域。
在分子生物学研究中，酶切位点的保护碱基是进行引物设计的重要参考依据之一、本文将介绍各种酶切位点的保护碱基以及在引物设计中的应用。
1.核酸酶A切割位点保护碱基核酸酶A（RNase A）是一种特定的核酸酶，能够将单链RNA切割为5'-磷酸核酸和3'-核磷酸。
核酸酶A识别和切割位点的保护碱基主要为对尿嘧啶核苷酸（Uridine，U）和鸟嘌呤核苷酸（Adenine，A）。
具体来说，核酸酶A主要作用于RNA链上U和A的周围碱基，特别是位于U或A的下一个碱基。
在引物设计中，需要考虑核酸酶A切割位点的保护碱基，以避免产生无法预测的酶切割产物。
特别是在设计RNA引物时，需要避免在酶切位点附近出现U和A的保护碱基。
2.核酸酶T1切割位点保护碱基核酸酶T1（RNase T1）是一种特定的核酸酶，能够识别并切割由磷酸鸟苷（Guanosine，G）形成的RNA链。
核酸酶T1在RNA链上识别和切割位点的保护碱基为G。
具体来说，核酸酶T1主要作用于G的下一个碱基。
在引物设计中，需要考虑核酸酶T1切割位点的保护碱基，以避免产生无法预测的酶切割产物。
特别是在设计RNA引物时，需要避免在酶切位点附近出现G的保护碱基。
3.限制性内切酶切割位点保护碱基限制性内切酶是一类广泛应用于DNA分子生物学研究的酶，其识别和切割DNA分子中的特定序列。
限制性内切酶识别和切割位点的保护碱基由酶自身的特异性决定。
每一种限制性内切酶都有其特定的酶切位点保护碱基要求。
一般来说，酶切位点的保护碱基主要存在于酶切位点的上下游碱基中。
在引物设计中，需要考虑限制性内切酶切割位点的保护碱基，以避免引物和酶切位点之间存在相互作用而导致切割不完全或无法切割的情况。
总而言之，在引物设计中，需要考虑各种酶切位点的保护碱基，以提高引物的特异性和稳定性。
根据不同酶的切割特点和要求，设计合适的引物序列可以避免酶切位点的保护碱基产生干扰，保证实验结果的准确性。
限制性内切酶酶切位点及保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl,25 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核昔酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核昔酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下标记0.1 A 260单位的寡核昔酸。
取1 Q已标记了的寡核昔酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6） , 10 mM MgCI 2,5 mM DTT S适量的NaCI 或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核昔酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
TCC CCCGGG GGA 12 >90 >90参看目录，选择共同的buffero其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
切。
3. 酶切底物DNA ,切不开1 ）底物DNA±没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。
常见限制性内切酶识别序列（酶切位点）,保护碱基,缓冲液
常见限制性内切酶识别序列（酶切位点）,保护碱基,缓冲液常见限制性内切酶识别序列(酶切位点),保护碱基,缓冲液在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5’端。
常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面，我就总结了一些常用的内切酶的识别序列，仅供各位参考。
下面这些内切酶都属于II型内切酶。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3'BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3'BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'A^GATCT 3'EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AATTC 3'HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3'KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3'NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CATGG 3'NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3'NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3'NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3'SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3'SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3'SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCATG^C 3'XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' T^CTAGA 3'XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^TCGAG 3'当然，上面总结的这些肯定不全，要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；NEB网站上提供的识别序列图表下载2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：/html/86.htmlNEB公司网站提供的保护碱基参考表下载/user1/2081/archives/2009/230768.shtml NEB公司网站上关于设计PCR引物保护碱基的参考/userfiles/file/protect.doc双酶切buffer的选择MBI/doubledigest/index.html罗氏http://www.roche-applied-/benchmate/refinder.htmNEB/nebecomm/DoubleDigestCalculator.as pPromega/guides/re_guide/research.asp?se arch=bufferTakara http://catalog.takara-bio.co.jp/en/product/basic_info.asp?unitid=U100005593 这里再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
详细酶切位点及保护序列
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，K pnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，S acII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
酶切位点(识别序列)
PCR引物设计时酶切位点的保护碱基表
不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求（在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
）
保护碱基：当酶切位点在双链DNA的尾端时，限制性内切酶经常不能成功切断(简单的想象为酶遇到识别位点之后从旁边掉下去了…… =_=|||)所以经常在引物设计时，在末端的限制性内切酶识别位点之后再加上2、3个碱基以确保成功酶切。
比如你的引物是5‘ GCTAGCNNNNN……3’ 可以改成5‘ CAG GC TAGCNNNNN……3’ 呃……CAG是我随便加的，你可以考虑一下CG/AT含量
注释
1.如果要加在序列的5’端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相
应的碱基（黑色），如果要在序列的3’端加上保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2.切割率：正确识别并切割的效率。
3.加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 µg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看)
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
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限制性内切酶酶切位点保
护碱基
Prepared on 22 November 2020
寡核苷酸近末端位点的酶切(CleavageClosetotheEndofDNAFragments(oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mMTris-HCl,10 mMMgCl2,5 mMDTT 及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列
首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。
其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变
DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列。