2010本科生第9讲

双水相萃取法是近年出现的很有价值的新型分离技术。 目前，已有数十种酶可用此法提取，此外，双水相萃 取法还可以分离核酸、生长素、病毒、干扰素、细胞 组织等。
双水相形成：绝大多数天然或合成的亲水性的聚合物 （如：聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯醇等）水溶液，在 与第二种亲水性聚合物或无机盐（K3PO4，MgSO4 （ NH4 ) 2 SO4混合，并达到一定的浓度时，就会产生两相。 如：PEG4000 6.6% / 磷酸盐14% 体系，提取人生长激 素，hGH分配在上相，细胞碎片等在下相，经过三级 错流萃取，总收率达到81%。
反胶束常用的表面活性剂有：AOT琥珀酸二酯磺酸钠， CTAB溴代十六烷基三甲铵，TOMAC氯化三辛基甲铵。 非极性的有机溶剂有环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷。 3 离子交换：离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机
溶剂的固态高分子材料，能与发酵液中带电荷的物质
进行阴、阳离子交换。发酵生产上广泛用于抗生素、 氨基酸、有机酸等的提取与精制以及水处理和蛋白质
2、下游加工过程的特点：
微生物发酵产品的品种很多，其下游一般有以下特点
a. 成分复杂：发酵液是复杂的多相系统。含有细胞、代谢产
物和残留的培养基等。 b. 产品浓度低：传统发酵产物浓度一般在1%~10%，活性物 质产品为0.01 %~1%。 c. 收率较低：由于杂质多，产品质量要求高，多步操作。
d. 失活问题：生物活性物质通常很不稳定。遇热、有机溶
b.盐析剂的种类：盐析效果好且常用的盐析剂有
(NH4)2SO4 ，Na2SO4 ，NaH2PO3等。 c.盐析剂的用量：盐析剂的用量与所沉淀的酶的种类
和酶液中的杂质的性质、数量有关，应以收率最高的
用量为标准。具体用量需通过对比试验和生产实践摸 索才能得到。如：目前生产淀粉酶（BF7658）， (NH4)2SO4用量为40%，生产葡萄糖氧化酶， (NH4)2SO4 用量为70%。 d.盐析的温度：盐析的温度选择以不降低酶的活力为原 则，可供选择的范围较大，一般是在常温下进行盐析。 e.盐析的pH：盐析的pH选择以不降低酶的活力为原则，
1.1.1盐析法原理：盐析又称中性盐沉淀法，在发酵液中加
入中性盐破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电 荷，促进蛋白质或酶沉淀。
蛋白质的溶解度与盐浓度之间的关系可用Cohn方程式来
表示：
log(S/S0)= –KsI
S—离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L），S0 —纯溶剂（即I=0）时， 蛋白质的溶解度（g/L） ；Ks — 盐析常数，与温度和
a. 如啤酒、葡萄酒、各种发酵饮料等。下游成本占生产成
本的10%左右。
b. 如乙醇、有机酸、氨基酸、抗生素、维生素等。下游 成本占生产成本的30%左右，能耗占60%以上，下游投资 占整个工厂投资的60%。
c. 重组DNA产品、精制蛋白质产品。下游成本占生产成本 的80%~90%，而且这种偏向还有继续加剧的趋势。
度）的限制，其固相的干度不如压滤。
Байду номын сангаас 3
叠片式离心机 属于沉降式的离心机， 是工业生产上应用最广 泛的离心机。一般用于 大规模的分离过程。
四
细胞的破碎
细胞的破碎分为：机械破碎法和非机械破碎法
1 机械破碎法
1.1 珠磨法：微生物细胞悬浮液与很细的研磨剂在搅拌桨 作用下快速搅拌或研磨，珠子之间以及珠子和细胞之 间互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放内含物。在珠 液分离器的作用下进行分离。
酵工业常用的是：聚丙烯酰胺类衍生物（用量70mg/L)、 天然有机高分子聚合物（明胶、海藻酸盐等）、无机
高分子聚合物（聚合铝盐、聚合铁盐）。
1.2.3 混凝：包括凝聚、絮凝的双重作用。 1.3 调整pH 调节发酵液的pH使之达到其等电点，可去除蛋白质等 两性物质。 1.4 加入助滤剂 在含有大量细小胶体粒子的发酵液中加入固体助滤剂， 助滤剂可作为细小胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼 层中，减小过滤的阻力。目前工业生产常用的助滤剂：
硅藻土、珍珠岩粉、石英沙等。
2 去除高价无机离子 Ca2+、Mg2+、Fe2+等影响树脂的交换容量 2.1 用草酸去除钙离子，草酸钙还能促进蛋白质凝固
2.2 三聚磷酸钠与镁形成可溶性络合物
Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ 2.3 黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+
离子交换树脂在使用一段时间后，需进行再生处理， 使树脂恢复原来的状态。酸型树脂用酸再生，碱型树用 碱再生 3.3 其他类型的树脂： 3.3.1 两性离子交换树脂：将两种性质相反的阴、阳离子
第九讲
第十二章 下游加工工程
一、下游加工工程概论 二、发酵液的预处理 三、发酵液的固液分离 四、细胞的破碎 五、发酵产品的提取 六、发酵产物的精制 七、成品的加工
一、微生物下游加工工程概论
1、下游加工过程在发酵生产中的地位
从微生物发酵液中分离、精制发酵产品的过程称为下游加工过程 （down stream process)。 下游加工的目标：高产、优质、低耗 按下游加工过程的难易程度，微生物的发酵产品可分 为三类：
制备过程中。
3.1 离子交换树脂的原理：离子交换树脂可以分成两部 分：一部分是不能移动的高分子基团构成的三维空间
网状骨架，使树脂具有化学稳定的性质；另一部分是
可移动的离子，称为活性离子，它在树脂的骨架中进 出，就发生了离子的交换。 3.2 离子交换树脂的结构与分类：根据活性离子进行分 类，如果活性离子是阳离子，即这种树脂能与阳离子
液过滤前加入0.025%的淀粉酶。
1.2 凝聚与絮凝 1.2.1 凝聚：加入某种电解质，在电解质异电离子的作 用下，胶粒的双电层电位降低，产生凝聚现象。凝聚 能力Al3+>Fe3+ >H + >Ca2+ >Mg2+ >K + >Na + 1.2.2 絮凝：絮凝是指在某些高分子絮凝剂的作用下，
基于桥架作用，使胶粒形成较大的絮凝团的过程。发
1.3 超声波法：是一种实验室内常用的细胞破碎方法，由 极为强烈的冲击波压力引起细胞破碎，超声波震荡容 易引起温度的剧烈上升，注意降温。超声波法处理各 种微生物的效果不同，一般杆菌好于球菌，G –好于G+
酵母的破碎效果较差。 2 非机械破碎法 2.1 酶溶法：利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键， 从而达到细胞破碎的目的。此法要注意选择适宜的酶
发生交换。就称为阳离子交换树脂。离子电离程度决
定树脂的酸性或碱性的强弱。
阳离子交换树脂是一类骨架上结合有磺酸（—SO3H） 或羧酸（—COOH），阴离子交换树脂骨架上结合有伯 胺基、仲胺基、叔胺基、季胺基的聚合物。 3.2.1 强酸性阳离子树脂： R · 3H SO R· 3– + H+ SO 3.2.2 弱酸性阳离子树脂： R· COOH R· COO – + H+ 3.2.3 强碱性阳离子树脂：(含季胺基） R· 3OH NR R· 3 + + OH – NR 3.2.4 弱碱性阳离子树脂: R· 2 + H2O NH R· 3 + + OH – NH
3
去除色素及其它物质
3.1色素产生 微生物生长代谢产生，培养基带来 3.2去除方法 离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等吸附 如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去 除非活性蛋白质
三 发酵液的固液分离
1 板框压滤机
比较适合固形物含量：1%~10%的悬浮液的分离。优点：
结构简单、过滤面积大、形成的固形物水份低。缺点： 设备笨重、非生产的辅助时间长，卫生条件较差。 可过滤体积：V=n×a × b × c 内的长、宽、厚度。 V台=K×V K为每台板框的压填系数（抗生素一般为： 0.5~0.8）。 n为框数，a、b、c为框
可选择等电点的pH作为盐析的pH，一般要通过试验选
择产物稳定的pH范围进行盐析。
1.2 等电点法：等电点法主要用于一些两性电解质的产物 中，如抗生素、氨基酸以及水化程度不大或憎水性的 蛋白质如酪蛋白等，其优点是无需后续的脱盐操作。 1.3 有机溶剂沉淀：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水 溶性的有机溶剂，有机溶剂分子能与大量的水分子结
板 框 压 滤 机 1- 尾板；2—滤框；3—滤板；4—主梁；5—头板；6—压 紧装置
2 真空转鼓过滤机
外滤面转鼓真空过滤机 1—转鼓 2—过滤室 3—分配头 4—物料槽 5—搅拌器 6—喷嘴 10—刮刀
适合固形物含量较大（>10%）的悬浮液的分离。工业生产 上适合霉菌发酵液的过滤分离。由于其推动力为（真空
pH无关 ；I —离子强度。
当温度一定时， S0的对于某一溶质是一个常数，即 log S0 =β， log S =β –KsI，
有时为了便于计算，也可用浓度代替离子强度，则： log S =β –Ksm
m —盐的摩尔数。
1.1.2 影响盐析的主要因素： a.蛋白质浓度：一般来说，高浓度的蛋白质溶液可以 减少盐的用量，低浓度的蛋白质溶液需要较多的盐， 常采用25%~30%的蛋白质浓度。
1.2 高压均质(匀浆）法：从高压室（几百个大气压）压 出的细胞悬浮液在高压下从阀室与阀杆之间的环隙高 速(450m/s)喷出，由于突然减压和高速冲击(撞击到碰 撞环)作用使细胞破碎。对于难以破碎、浓度高的细胞 悬浮液可采用多次循环操作。
影响细胞破碎的主要因素是压力、温度和循环次数。
ln 1/(1–R)=KNPα R—破碎率，K—与温度有关的速度常数，N—操作压 力，α—与微生物种类有关的常数，P—循环次数
2.3 反（逆）胶束（团）萃取法：当表面活性剂溶于水中， 并使其浓度超过CMC （Critical Micelle Concentration) 时，表面活性剂就会在水溶液中形成集聚体，称为正 常胶束（normal micelle)。 反胶束(reversed micelle)是表面活性剂分散于连续有机 相中自发形成的纳米尺度的聚集体，具有热力学稳定 的系统。反胶束中有一个极性核心，被称之为“水 池”。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶 液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用 进入“水池”，由于周围水层和极性基团的保护，保 持了蛋白质的天然构型，因而不会造成失活。