血红蛋白的提取和分离培训课件
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血红蛋白的提取和分离PPT课件
血红蛋白的提取和分泳法
1、蛋白质特性的差异
(1)分子的形状和大小；
(2)所带电荷的性质和多少；
(3)溶解度；
(4)吸附性质；
(5)对其他分子的亲和力。
2、分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 ①概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大 小分离蛋白质的有效方法。 ②凝胶：微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构 成，内含许多贯穿通道,如葡聚糖或琼脂糖。
③电泳常用方法 a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子 在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大 小和形状的不同而不同，从而得以分离。 b.聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入SDS作用：掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 迁移率完全取决于分子的大小。（原理：SDS使蛋白质发 生完全变性，解聚成单条肽链，并与其结合形成蛋白质— SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的 电荷量。测定的结果只是单条肽链的分子量）
以哺乳动物红细胞为材料，血红蛋白质的提取和分 离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
（一)样品处理及粗分离 1、红细胞的洗涤 (1)目的:去除杂蛋白； (2)过程：
(3)实验注意事项：为防止血液凝固，加入抗凝血剂柠檬 酸钠。生理盐水洗涤防止红细胞吸水涨破。低速短时 离心。如果离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细 胞一同沉淀，达不到分离的效果。④洗涤次数过少，无法 去除血浆蛋白,分层不明显⑤上清无黄色，表明细胞已洗净。
3、缓冲溶液 ①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱对PH的 影响，维持pH基本不变的溶液。 ②缓冲溶液的配制 1～2种缓冲剂 调节使用比例控制pH范围
二、血红蛋白的提取和分离 血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α-肽链和两条
1、蛋白质特性的差异
(1)分子的形状和大小；
(2)所带电荷的性质和多少；
(3)溶解度；
(4)吸附性质；
(5)对其他分子的亲和力。
2、分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 ①概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大 小分离蛋白质的有效方法。 ②凝胶：微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构 成，内含许多贯穿通道,如葡聚糖或琼脂糖。
③电泳常用方法 a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子 在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大 小和形状的不同而不同，从而得以分离。 b.聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入SDS作用：掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 迁移率完全取决于分子的大小。（原理：SDS使蛋白质发 生完全变性，解聚成单条肽链，并与其结合形成蛋白质— SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的 电荷量。测定的结果只是单条肽链的分子量）
以哺乳动物红细胞为材料，血红蛋白质的提取和分 离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
（一)样品处理及粗分离 1、红细胞的洗涤 (1)目的:去除杂蛋白； (2)过程：
(3)实验注意事项：为防止血液凝固，加入抗凝血剂柠檬 酸钠。生理盐水洗涤防止红细胞吸水涨破。低速短时 离心。如果离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细 胞一同沉淀，达不到分离的效果。④洗涤次数过少，无法 去除血浆蛋白,分层不明显⑤上清无黄色，表明细胞已洗净。
3、缓冲溶液 ①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱对PH的 影响，维持pH基本不变的溶液。 ②缓冲溶液的配制 1～2种缓冲剂 调节使用比例控制pH范围
二、血红蛋白的提取和分离 血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α-肽链和两条
血红蛋白的提取和分离经典ppt课件.ppt
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
（A为正面，B为剖面） 1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3
10
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先 处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所 带电荷的性质和分子的大小、形状。
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 红细胞的洗涤
样品处理 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液
粗分离：透析—去除样品中分子量较小的杂质
纯化：用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的
杂质
纯度鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）操作过程
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
原理：
当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 容易进入
凝胶内部的通道
相对分子质量较大
无法进入凝胶 内部的通道
只能在凝胶外部移动
路程较长 移动速度较慢
路程较短 移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
电泳槽
迷你双垂直电泳槽
卧式电泳槽
等电聚焦多用电泳槽
9
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
（A为正面，B为剖面） 1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3
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篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先 处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所 带电荷的性质和分子的大小、形状。
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 红细胞的洗涤
样品处理 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液
粗分离：透析—去除样品中分子量较小的杂质
纯化：用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的
杂质
纯度鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）操作过程
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
原理：
当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 容易进入
凝胶内部的通道
相对分子质量较大
无法进入凝胶 内部的通道
只能在凝胶外部移动
路程较长 移动速度较慢
路程较短 移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
电泳槽
迷你双垂直电泳槽
卧式电泳槽
等电聚焦多用电泳槽
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篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
血红蛋白的提取与分离课件
血红蛋白的提取与分离
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㈢电泳：
电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
1）原理：
不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、 电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用 力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在 电场中的运动方向和运动速度不同。
思考：蛋白质为什么带有电荷？
在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷 2）影响蛋白质分子运动速度的因素
就可以制得（ 在不同PH范围内 ）使用的 缓冲液。
思考：说出人体血液中缓冲对。
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3 / NaHCO3
血红蛋白的提取与分离
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思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲 液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白 的正常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性）
高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲
液（pH为7.0）充分（ 洗涤平衡 ）12小时。
注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终 生物大分子物质的分离效果。不能发生洗 脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重 新填装。
血红蛋白的提取与分离
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3）样品加入与洗脱
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除（ 杂质蛋白 ） ②方法：（ 低速短时间 ）离心（速度越 高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头 吸管吸出上层透明的（黄色血浆），将下 层（ 暗红色）的红血红细蛋白的胞提取液与分离体倒入（烧杯）20
再加入用（ 五倍体积）的（ 生理盐水） 质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间）
血红蛋白的提取和分离人教精品PPT.
3.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关
操作，其中正确的是（ ）
A．可采集猪血作为实验材料 ．用蒸馏水重复洗涤红细胞
AB
C．血红蛋白释放后应低速短时间离心
D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流
出液
谢谢观看！ 通常使用10％以下的稀酸操作，在于维持需要的pH值，否则会导致成分的破坏或水解。为发挥加酸的最好效能，较好地控制其用量，
⑴.概念：
带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 ⑵.电泳原理：
电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及 分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速 度，从而实现样品中各种分子的分离。
⑶.常见电泳类型：
①琼脂糖凝胶电泳
迁移率取决于它所带
净电荷的多少以及分
②聚丙稀酰胺凝胶电泳 子的大小、形状。
往往能将酸一次加于最初的少量浸出溶剂中。当酸化溶剂用完后，继续使用单纯的溶剂，完成浸的操作。例如，在最初部分溶剂中加 入教0学.1目％的枸：椽酸所制得的黄连流浸膏中，小檗碱含量、稳定性优于单用水浸提者。动物生化制剂浸提时，pH值的影响更为显著。 12、温禁度止：到非游泳区游泳，要在游泳馆、池或标有无危险标记的游泳区游泳。 （观2察）课碱本：上的图15-14，发现电路中的开关都接在了哪根线上？能解释一下原因吗？ 学客校户的 看安车全时工怎作么直应接对关系到办学质量，学校的信誉和学生的健康成长，也关系到家庭的幸福、社会的稳定。因此，我们必须增强广大 师1.3生.7的借安助全推意荐识渠，道强化学校安全教育力度，普及安全防范知识，加大学校安全管理措施，做到安全工作警钟长鸣，确保师生平安。 2不、要协乘助坐校超长载做的好船学只校；消不防要安在全船工上作嬉，戏对打校闹园；内不的要消冒防险安乘全船管。理工作负分管责任。 25． 号组位织是学车生的参侧加身大，型很集 多体销活售动人，员应认当为采车取的下侧列面安很全难措介施绍：，其实这个地方是很重要的，因为买车的客户最关心的还是安全，销售人员可 3以.禁跟止客在户计这算样机讲网：络大上家发看表，违一法般或的有车害是国有家三的个议柱论子。，我们称之为A柱B柱和C柱，很多汽车销售公司的员工不知道A柱、B柱和C柱应该 7介.配绍合什新么闻。出其版实、这公里安边、的工填商充行物政可管以理抗等击部冲门击依。法取缔学校周边兜售非法出版物的游商和无证照摊点，查处学校周边制售含有淫秽色 情认、同凶 对杀方暴的力观等点内容的出版物的单位和个人。
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解聚成单条肽链，因此测定的结果只是
单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质
形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电
荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷
量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷
差别，使电泳迁移率完全取决于分子的
大小。
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血红蛋白的提取和分离
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使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋 白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异
（2）原理：
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取
决于它所带净电荷的多少以及分子的大
小等因素。
为了消除净电荷对迁移率的影响，可以
在凝胶中加入SDS。 2/4/2021
血红蛋白的提取和分离
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4、聚丙稀酰胺凝胶电泳
（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽
链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会
5
• 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中 的进行过程可表示为图中哪一个
•B
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血红蛋白的提取和分离
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㈡ 缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少 量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发 生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓 冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用： 能够抵制（ 外界的酸或碱 ）对溶液 （ pH值 ）的影响，维持PH基本不变。
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血红蛋白的提取和分离
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2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中， 关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于 相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于 相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于 相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较
分离血红蛋白溶液
有机溶剂 无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体
红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
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血红蛋白的提取和分离
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透析过程动画演示
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血红蛋白的提取和分离
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练习巩固
1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋 白质的研究和应用越来越深入，首先要 做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质
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血红蛋白的提取和分离
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3、缓冲溶液的配制
通常由（ 1－2 ）种缓冲剂溶解于水中
配制而成。调节缓冲剂的（ 使用比例 ）
就可以制得（ 在不同PH范围内
）
使用的缓冲液。
4、在本课题中使用的缓冲液？
磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和 功能，便于观察(红色)和科学研究其(活性)
思考：说出人体血液中缓冲液。
一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理
㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）
1、凝胶：
一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通 道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）
2、概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法
3、原理：
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血红蛋白的提取和分离
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一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 4、具体过程
3.类型琼: 脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
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血红蛋白的提取和分离
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在电场的作用下，这些带电分子会向着与 其所带电荷相反的电极移动
琼脂糖凝胶电泳示意图
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血红蛋白的提取和分离
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4、聚丙稀酰胺凝胶电泳
（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰
胺和交联剂N,N，—亚甲基双丙烯酰胺在引发 剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维 网状结构的凝胶。
小
小于凝胶颗粒空 隙直径，可以进 入颗粒内部
垂直向下移动， 无规则扩散进入 颗粒
• 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量
大的蛋白质
D
• A．路程较长，移动速度较慢
B．路程较长，移动速度较快
• C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快
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血红蛋白的提取和分离
NaH PO / Na HPO H CO / 2 2/4/2021
4
2
4 2 血红蛋白的提取和分离
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NaHCO8 3
（三） 电泳：
1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
2.原理①：许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下， 这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用 下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的 电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分 子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状 的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从 而实现样品中各种分子的分离。
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血红蛋白的提取和分离
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血红蛋白的提取和分离
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一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理
分子量
直径大小
运动方式
运动速度 运动路径 洗脱次序
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大 大于凝胶颗粒空 隙直径，被阻挡 在颗粒的外面
垂直向下移动
较快 较短 先从凝胶柱洗脱 出来 血红蛋白的提取和分离
电泳鉴定。
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血红蛋白的提取和分离
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二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
知识回顾
1. 血液有哪些成分？
水分
血浆
血
其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
液 血细 胞
白细胞 血小板
红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好
2、血红蛋白的释放：
在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放
3、分离血红蛋白溶液：
红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→ 滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明 液体。
4、透析：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）
装入2/4/2透021 析袋并置于磷酸血红缓蛋白冲的提取液和分中离 （PH为7.0）透析16 。
哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
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血红蛋白的提取和分离
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二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 （一）样品处理
1、红细胞的洗涤：
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍 体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液 →反复洗涤直至上清液无黄色
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血红蛋白的提取和分离
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二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血
红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红
蛋白溶液。
（2）粗分离：透析除去分子较小的杂
质。
（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量
较大的杂质蛋白质除去。
（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶