贵州木霉NJAU4742几丁质酶基因chi 8的克隆、表达和酶学特性研究

南京农业大学学报2021,44(1):111-118
Journal of Nanjing Agricultural University http : / /n auxb .njau. edu . cn DOI ：10.7685/jnau.202003042王小松，马磊，刘志颖，等.贵州木霉NJAU4742几丁质酶基因chi8的克隆、表达和酶学特性研究［J ］.南京农业大学学报,2021,44(1)：111-118. WANG Xiaosong,MA Lei , LIU Zhiying , et al. Cloning , expression and enzymology oharaoteristios of an endo-chitinase gene chi8 from Trichoderma guizhouense NJAU4742］ J ］. Journal of Nanjing Agricultural University,2021 ,44( 1) ：111-118.
贵州木霉NJAU4742几丁质酶基因chi8的克隆、
表达和酶学特性研究
王小松，马磊，刘志颖，李托，朱瀚，刘东阳”，沈其荣
(南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室，江苏南京210095)
摘要：［目的］本研究旨在从贵州木霉(Trichoderma guizhouense NJAU4742)菌株中克隆、表达几丁质酶基因chi8并深入研究 其酶学特性，分析Chi8水解胶体几丁质的产物，为其在农业生产中的实际应用提供理论依据。

［方法］基于序列比对获取 chi8与其他几丁质酶基因的同源关系，并设计引物扩增得到完整的chi8序列，利用pET-29a 质粒和大肠杆菌BL21进行异 源表达;经镍柱纯化后并研究Chi8酶学特性;利用MALDI-TOF/MS 检测Chi8水解胶体几丁质的最终产物;基于同源建模 法构建Chi8的三维模型并与几丁六糖进行对接获取其催化相关位点信息。

［结果］本试验克隆、表达得到的Chi8与哈茨木 霉几丁质酶(ACM47359)的序列相似度为93.38%；Chi8在30~40 V 酶活性较高且能保持较好的热稳定性，在pH6.0时酶活 性为0.50 U-Fimol -1 -h -1 ；Ca 2+可以显著提高Chi8的酶活性，可达到原酶活性的110.62%，而Co 2+、Cu 2+、Fe 3+均有抑制作用， 与酶作用后Chi8酶活性下降至原酶活性的89.70%、60.17%和5.93%；在酸性条件下,Chi8水解胶体几丁质的最终产物主要 为几丁二糖［(GlcNAc)」。

Chi8同源建模结果表明,其含有18个螺旋和15个0-折叠,末端的IMD 残基可形成1个咪唑 环;底物对接结果表明，Chi8中Asn197、Trp110、Tyr218、Arg274、Arg31可以与几丁六糖形成氢键，可能为该蛋白的活性中 心。

［结论］本试验克隆、表达得到的几丁质酶Chi8具有良好的生化特性，能够高效水解胶体几丁质并生成壳寡糖，产物主 要为几丁二糖。

关键词:贵州木霉;几丁质酶;异源表达;酶学特性;壳寡糖;蛋白同源建模
中图分类号:S154.3 文献标志码：A 文章编号：1000-2030( 2021) 01-0111-08
Cloning , expression and enzymology characteristics of an endo-chitinase
gene chi8 from Trichoderma guizhouense NJAU4742
WANG Xiaosong , MA Lei ,LIU Zhiying , LI Tuo , ZHU Han , LIU Dongyang * , SHEN Qirong
(Jiangsu Key Laboratory for Organic Solid Waste Utilization ,Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095,China)Abstract : ［ Objectives ］ The purpose of this study was to clone chi8 gene from a beneficial strain Trichoderma guizhouense NJAU4742, and then to obtain the pure Chi8 protein through the heterologous expression by Escherichia coli expression system and the enzymology characteristics of Chi8 by evaluating the enzyme activity under different conditions ，and to analyze the hydrolysates by using colloidal chitin as substrate ， which will provide theoretical basis for its practical application in agricultural wastes treatment. 「Vlelhods ］The homology of chi8 gene with other chitinase genes was obtained by sequence alignment ,and the open reading flank of chi8 was amplified based on speoifio primers and then heterologously expressed in E. coli BL21 by using the pET-29a vector. The enzymology characteristics of Chi8 was obtained by determining the activities at different conditions with DNS method after purifica ­tion by nickel gel , and the MALDI-TOF/MS method was used to detect the final product of colloidal chitin hydrolyzed by Chi8. Construction of three-dimensional model of Chi8 and docking results with chitohexaose hydrochloride was based on homologous modeling. ［ Results ］ Chi8 encoded by Trichoderma guizhouense NJAU4742 owned a highest sequence similarity (93.38%) with the chitinase from Trichoderma harzianum ( ACM47359). Chi8 owned high enzyme activities and maintained a considerable thermal stability between 30 V and 40 V ， meanwhile the enzyme activity was the highest when the pH value reached 6. 0. Ca 2+ could increase the activity of Chi8 signific-antly ,and the activity reached to 110.62% of that in CK,while the co-reaction with Co 2+ , Cu 2+ and Fe 3+ showed inhibitory effects with only 89.70%, 60.17% and 5.93% of the enzyme activity by compared to CK, respectively. Under the condition of weak acid ，colloidal chitin was used as the substrate for hydrolysis ，and the final product was mainly chitobiose 收稿日期：2020-03-20
基金项目：国家自然科学基金项目(31972513)；江苏省农业科技自主创新资金项目［CX( 18)3059］；江苏省重点研发计划(现代农业)项目
( BE2018338)
作者简介:王小松，硕士研究生。

*通信作者:刘东阳，教授，主要从事农业废弃物资源化利用和生物有机肥研究，E-mail ：liudongyang@njau.
。

112南京农业大学学报第44卷
(GlcNAc)2-The protein homologous structure model of Chi8indicated that it contained18helices and150-barrel,with an IMD residue as the imidazole ring at the end.The substrate docking results showed that Asn197,Trp110,Tyr218,Arg274and Arg31in Chi8could form hydrogen bond with chitohexaose hydrochloride,which might be the active center of this protein.［Conclusions］Chi8 owned a considerable capacity of efficient decompose colloidal chitin to generate chitosan oligosaccharides,and the major products were(GlcNAc)2and chitin monosaccharide.
Keywords:Trichoderma guizhouense；chitinase；heterologous expression；enzymology characteristics；chitooligosaccharides；protein homology modeling
几丁质又称为甲壳素，是由0-1,4-糖苷键将N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)连接而成的高分子多聚物，广泛分布在真菌细胞壁及昆虫、甲壳类动物、线虫的外骨骼中，是自然界中分布最广泛的氨基多糖［1］。

几丁质脱乙酰化产生的壳聚糖，是一种含有GlcNAc和D-葡萄糖胺(GlcN)的聚合物，。

-葡萄糖胺通常占残留物的80%［2］。

壳寡糖的生物活性主要取决其分子质量及所带电荷量［3-6］，它通常使用化学降解法来制备，而酶促转化是一种更环保、可控的方法。

几丁质酶以随机的方式
水解几丁质糖链上的糖苷键，水解产物为可溶性低分子质量混合物。

几丁二糖酶，可从非还原端裂解几丁质和几丁质聚合物,最终产物为二乙酰几丁二糖［(GlcNAc)2】［7］。

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，同样从非还原端裂解几丁质和几丁质聚合物，最终产物为GlcNAc⑹。

产生几丁质酶的微生物主要为细菌、放线菌、真菌，不同微生物产生的几丁质酶并不相同，如酿酒酵母能产生2种几丁质酶cts1和cts2［9］o木霉属(Trichoderma spp.)真菌广泛存在于各种生态系统,共包含8个集合种［10］，它是一类生长繁殖迅速、适应环境能力强、高效利用养分和空间的丝状真菌，寄生在其他真菌细胞表面后通过分泌几丁质酶、蛋白酶等细胞壁降解酶来实现对真菌细胞壁的溶解，被广泛应用于生物防治［11-14］。

本试验利用本实验室保存的一株木霉菌株Trichoderma guizhouense NJAU4742,通过克隆、表达获得几丁质酶Chi8,以胶体几丁质为底物，在不同的温度、pH值、金属离子条件下测定其酶活性及其热稳定性,再利用质谱鉴定其水解产物，旨在为几丁质的资源化利用提供坚实的理论和物质基础。

1材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株和质粒菌株Trichoderma guizhouense NJAU4742、质粒pET-29a、克隆菌株Escherichia coli DH5a 以及表达宿主E.coli BL21(DE3)均由本实验室保存。

1.1.2培养基液体LB培养基:蛋白胨10g,酵母提取物5g、NaCll0g、去离子水1L,pH7.0。

固体LB 培养基:在液体LB培养基中加15g-L-1的琼脂。

1.1.3主要试剂限制性内切酶Eco RI、Kpn I(TaKaRa公司)；硫酸卡那霉素、氨苄青霉素(GENVIEW 公司)；IPTG(北京索莱宝科技有限公司)；细胞裂解液(50mL体系)：
2.5mL1mol-L-1Tris(pH8.0)、4mL 5mol-L-1NaCl、50^L0.1mol-L-1PMSF(苯甲基磺酰氟)、5mL50%甘油,38.45mL ddH2O；甲壳素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖(上海源叶生物科技有限公司)。

1.2方法
1.2.1基因的克隆基于NJAU4742的基因组数据库(/tgn4742/)设计引物，正向弓I物:AGCCCCCTGGCTACAGAAGAG；反向弓I物:TTAGTTCAGACCGTTCCTGATGTT。

提取NJAU4742菌株总RNA后反转录得到cDNA,以cDNA为模板扩增chi8(A1A104090.1)o PCR反应体系(50咽): 5xPrime STAR®Buffer(Mg2+plus)10jiL,dNTP Mixture(2.5mmol-L-1)4»L,正、反向引物(10fimol-L-1)各1iL,cDNA1iL,DNA聚合酶(2.5U・iLT)0.5咽,灭菌蒸馏水32.5咽。

每个样品设2个重复。

反应条件：98弋2min;98弋10s,55弋15s,72弋1min,循环30次;72弋10min,10弋10min。

1.2.2系统发育树及Motif分析利用BLAST()筛选其他相似序列，在Non-Redun-dant Protein Sequence数据库中筛选相似度高的31条氨基酸序列，利用1000个重复的bootstrap值构建邻接树，检测序列间的距离，分析Chi8与其他几丁质酶的同源关系［15］。

利用MEME(http：/// index.html)的Motif Discover工具预测不同蛋白序列的Motif信息。

1.2.3载体构建及热激转化将20iL反应体系(2iL EcoR I,2»L Kpn I,14»L pET-29a质粒与2»L 10xM Buffer)混合均匀，在37七水浴锅中进行双酶切20h后回收酶切产物。

用T4连接酶在16七条件下
第1期王小松，等:贵州木霉NJAU4742几丁质酶基因chi8的克隆、表达和酶学特性研究113
反应16ho将酶连产物与DH5a感受态细胞混合，放置冰上30min，转移至42V水浴锅中热激90s,再置于冰上2min,转移至装有9001L LB培养基的灭菌离心管中，于37V.100r-min-1摇床上复苏1h,4V、3000~5000r-min-1离心3min,沉淀重悬后取100咽涂布在LA（LB培养基中添加50.0mg-L-1氨苄青霉素）固体培养基上,37V培养14~16ho挑选转化子进行验证。

1.2.4几丁质酶的异源表达、纯化和验证将阳性克隆转接至添加30mg-L-1硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37V、200r-min-1的摇床上培养，当D600达到0.5时，每升培养基中加入0.5mmol IPTG进行诱导，同时将培养条件改为16V、100r-min-1培养12h。

培养结束后在4V、10000r-min-1离心5min，收集菌体，利用1XPBS溶液进行重悬，将重悬液转移至50mL新离心管中，在4V、8000r-min-1离心5min，弃上清液后称重。

将菌体与细胞裂解液以1：10（质量体积比）的比例混合后进行重悬,在冰水混合物中超声破碎菌体后,4V、8000r-min-1离心1h,利用SDS-PAGE分析验证。

利用蛋白纯化仪（NGC10,伯乐）纯化上述制备的胞内总蛋白。

平衡液（pH8.0）为50mmol-L-1 NaH2PO4a300mmol•L-1NaCl A10mmol•L-1咪唑,0.22或0.45im滤膜过滤除菌；洗脱液（pH8.0）为50mmol-L-1NaH2PO4、300mmol-L-1NaCl、500mmol•L-1咪唑,0.22im滤膜过滤除菌。

梯度洗脱后得到Chi8纯化蛋白，用Bradford方法测定蛋白浓度，利用SDS-PAGE分析纯化的Chi8蛋白。

蛋白鉴定主要仪器:冷冻干燥仪（上海卢湘）、EASY-nLC1000系统（Thermo Soientifio）、LTQ Orbitrap Velos Pro（Thermo Soientifio）;主要试剂：脱色液［25mmol-L-1NH4HCO3、50%（体积分数）乙月青水溶液］、脱水液1（50%乙青水溶液）、脱水液2（100%乙青）、还原液1（含10mmol-L-1DTT和25mmol-L-1NH4HCO3的水溶液）、还原液2（含50mmol-L-1碘乙酰胺和25mmol-L-1NH4HCO3水溶液）、吸胀液（25mmol-L-1 NH4HCO3水溶液）、酶解覆盖液（25mmol-L-1NH4HCO3水溶液）、酶解工作液（含0.02ig-iL-1胰蛋白酶的酶解覆盖液）、肽段萃取液（含5%甲酸、67%乙青的水溶液）。

1.2.5Chi8酶学特性及其对胶体几丁质的水解动力学参数测定胶体几丁质的制备和标准曲线的制作:称取5g几丁质缓慢加入100mL浓盐酸中，并用磁力搅拌器混匀,4V环境下放置24h后加入300mL 50%（体积分数）的乙醇溶液,然后用去离子水洗至溶液呈中性。

N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线配制方法:用1mg-mL-1N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准溶液制备不同浓度的溶液，并与DNS反应后在酶标仪520nm 波长下测定吸光值,将N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量作为纵轴,吸光值作为横轴绘制标准曲线（y=0.147仏-0.0037,R2=0.9937）。

不同条件下几丁质酶活性的测定:测定方法根据文献［13,16］的方法进行适当调整。

1mL反应体系包括20iL几丁质酶液、400iL胶体几丁质、580iL醋酸缓冲液（pH6.0）；对照（CK）加入20iL的灭活酶液（反应体系中蛋白量为0.5imol）。

37V、200r-min-1条件下反应1h后转移至冰上，离心后取上清液与等体积DNS混匀,沸水浴10min,冷却后520nm波长下利用酶标仪测定吸光值。

以1imol酶溶液1h产生的还原糖定义为1个酶活性单位（U）,每个处理3个重复。

测定不同pH值对酶活性的影响时，分别加入pH值为4.0,5.0的磷酸缓冲液,pH值为5.0、6.0、7.0的醋酸缓冲液和pH值为7.0、8.0、9.0的Tris-HCl 缓冲液。

测定温度对酶活性的影响时，温度梯度设定为20、30、40、50、60、70和80V。

测定金属离子对酶活性的影响时，分别加入100iL50mmol-L-1的NaCl、CaCl2、FeCl3、CoCl2、CuCl2溶液，同时加入480iL醋酸缓冲液。

测定Chi8热稳定性时,分别将蛋白在30、37、40、43、47和50V条件下水浴处理20、40、60、80、100和120min。

测定Chi8底物特异性时，底物分别为胶体几丁质、几丁质、羧甲基壳聚糖、壳聚糖。

1.2.6降解产物分析在50mL反应体系中分别加入20mL胶体几丁质、29mL醋酸缓冲液（pH6.0）、1mL几丁质酶液,37V、200r-min-1反应12h,得到水解产物。

将上述产物11000r-min-1离心去除剩余底物,上清液与氯仿、正丁醇按体积比25：4：1混匀，剧烈摇晃20min,高速离心去除变性蛋白质,利用考马斯亮蓝法检测残留蛋白。

利用碳柱（Supelclean TM ENVI-Carb TM SPE管）洗脱去除盐离子，用不同浓度乙青+三氟乙酸混合溶液梯度洗脱，旋转蒸发浓缩至原体积的1/5后，利用MALDI-TOF/MS检测产物的成分。

1.2.7Chi8的同源结构建模及底物模拟对接利用SMART（smart.embl-heidelberg.de）在线预测Chi8的结构域，选中genomic模式，对Chi8的氨基酸序列进行比对;利用SWISS-MODEL（）将Chi8的氨基酸序列与PDB数据库已知结构的蛋白质进行比对来预测模型,并利用PyMOL软件进行优化,得到蛋白同源结构［17］。

利用AutoDock（/）对Chi8进行半柔性对接（其中受体蛋白设为刚性，配体小分子设为柔性），利用分子软件提取配体（几丁六糖），并利用Autodock toolkit加氢，
114南 京 农 业 大 学 学 报第 44 卷计算电荷，确认质子化状态后保存为ligand.pdb,作为分子对接的配体结构。

将Chi8的同源结构蛋白删掉 多余的水分子，保存为protein.pdb ,作为分子对接的受体结构,最后用AutoDock Tools 将配体和受体进行 对接。

2结果与分析
2.1基因的克隆及其生物信息学分析
将PCR 扩增获得的chi8完整片段进行琼脂糖凝胶电泳分析，获得约为1 200 bp 条带,与理论片段长 度1 224 bp 相符(图1-A)。

目的基因与pET-29a 融合后获得重组质粒pET-29a-chi8,其电泳条带约为 4 600 bp,也与理论片段相符(图1-B)。

选取31种来源于不同微生物的几丁质酶基因序列进行分析，根 据相似性高低可将其分为3个主要的聚类，第I 类全部属于木霉属真菌，其中哈茨木霉的几丁质酶 (ACM47359)与chi8的序列相似度高达93.38%。

第II 、皿类中主要包括青霉属(Purpureocillium lilacinum )、 Escovopsis 属(Escovopsis weberi )和葡萄穗霉属(Stachybotrys elegans )等，这些真菌具有一些相同的生物特性， 如对外界条件适应性强，代谢能力强，可以利用纤维素、几丁质等高聚合物作为碳源。

chi8具有7个典型的 Motif,与哈茨木霉和土抱木霉的几丁质酶完全一致,因此可以推测chi8与两者功能一致，具有良好的几丁质 水解活性(图1-C)。

B A bp
2 0001000
750500250100M 1bp 5 0003 000
2 000
1 000
750
500
250
100
M 1 2
XP 018655882 Trichoderma gamsii Chitinase ACO72604 Trichoderma atroviride Chitinase ALP68796 Trichoderma koningiopsis Endochitinase AAF19612 Trichoderma koningii Endochitmase AIR72290 Trichoderma erinsceum Chitinase ACC60385 Trichoderma hamatum Endochitmase AAW31950 Trichoderma aureoviride Endochitmase ABD42921 Trichoderma longibrachiatum Endochitmase AMY96562 Trichoderma asperellum Endochitmase CAE53388 Trichoderma lixii Endochitinase Endochitmase ADB89219 Trichoderma satumisporum Endochitmase ACM47359 Trichoderma harzianum Chitinase OPB43505 Trichoderma guizhouense Endochitmase BAB40593 Trichoderma viride Endochitinase BAB40594 TYichoderma pseudokoningii Endochitinase ADF57310 Trichoderma cirtrinoviride Chitinase ADF57309 Trichoderma ghanense Chitinase ACZ63268 Trichoderma longigrachiatum Chitinase OIA04600 Trichoderma parareesei Chitinase KOS22803 EScavopsis -weberi Chitinase j — AAM70478 Stachybotrys elegans Endochitmase — CEJ81295 Tbmubieffa hemipterigena Endochitmase XP 018149462 Pochonis chlamydosporia Endochitmase XP 018173934 Purpureocillium Wacinum Endochitmase AAP45631 Lecanicillium f iingicola Chitinase ABQ57240 Lecanicillium p salliotae Chitinase ALG03244 Cordyceps f iimosorasea Endochitinase XP 006672675 precursor Cordyceps Chitinase AGS 15320 Akanthomyces attenuatus Endochitmase AFR13053 Cordyceps confragosa Endochitmase ABD77095 Cordyceps confragosa Chitinase Motif 1 ；Motif 2；Motif 3;Motif 4；Motif 5；Motif 6；Motif 7;Motif 8;Motif 9；Motif 10；Motif 11；Motif 12；■ Motif 13；Motif 14；Motif 15
图1几丁质酶chi8基因的克隆及其信息学分析
Fig. 1 Cloning and informatics analysis of chitinase chi8 gene
A. chi8完整片段的电泳图;
B.重组质粒的电泳图(M. DNA 标准品;泳道1为pET-29a 空载质粒线性化片段，泳道2为pET-29a-chi8重组 质粒线性化片段);
C. chi8基因信息分析(左图为基因序列比对结果，右图为对应基因的功能模块分析)。

A. The electrophoretic image of complete chi8 fragment ；
B. The electrophoretic image of the linearized recombinant plasmid ( M is the marker , lane 1 is the linearized fragment of pET-29a,lane 2 is the linearized fragment of PET-29A-chi8 recombinant plasmid) ；
C. The gene information analysis of chi8 ( The left is the gene sequence alignment result,and the right one is the functional module analysis of the corresponding gene)
.
第1期王小松，等:贵州木霉NJAU4742几丁质酶基因chi8的克隆、表达和酶学特性研究
1152.2 Chi8的表达、纯化与质谱鉴定
利用大肠杆菌原核表达系统对chi8进行诱导表 达，每升培养基加入0.5 mmol-L -1 IPTG 培养一段时间 后,可以成功诱导目的基因表达，表达蛋白的电泳分 析结果如图2所示。

以空载菌株表达的蛋白条带1 作为对照，在2、3蛋白条带相对分子质量约46X103
的位置清晰可见1条新的蛋白条带，而且蛋白条带比 较浓。

该条带的相对分子质量与理论相对分子质量 (46.365X103)相近，说明NJAU4742菌株的几丁质酶
基因chi8已在大肠杆菌BL21中成功表达。

为了进一
步验证表达的蛋白为目的蛋白，将该蛋白进行特征性 肽段的质谱鉴定。

根据LC-MS 蛋白肽段鉴定结果(结
果未展示)，共检测到17条用于蛋白质鉴定分析的肽
段，其中4个特征性的肽段(AGATIQYDSVAIJALGG-
LDTTQNLLSYPNSK 、ANGYANSVYFTNWGIYDR 、ANG- YASVYFTNWGIYDR )与 NJAU4742 菌株中几 丁质酶 Chi8肽段的覆盖率高达51.16%o 因此，蛋白质电泳
结果和特征性肽段质谱检测结果表明,纯化蛋白是来
源于贵州木霉NJAU4742菌株的几丁质酶Chi8o 2.3 Chi8的酶学性质分析胚/10’
170
130
100
7055
4035
25M 1 2 3图 2 Chi8 的 SDS-PAGE 分析
Fig. 2 SDS-PAGE analysis of Chi8
M.标准蛋白；1. pET-29a 空载转化菌株胞内总蛋白;2. pET-
29a-chi8转化菌株胞内总蛋白;3.纯化后的蛋白。

M. The standard protein marker ； 1. Total intracellular protein of the pET-29a transformed strain ； 2. Total intracellular protein of pET-
29a-chi8 transformed strain ；3. Purified protein.
从图3-A 可知:几丁质酶Chi8在30~40 V 的酶活性比较咼，而在低温下(20 V 左右)依旧能保持较 高活性，温度达到50 V 时酶活性显著降低,温度继续升高后则基本失活，可能是在高温条件下蛋白质结构 发生改变，不能形成与底物结合的空间结构，从而失去降解底物的能力。

从图3-B 可知：5 mmol-L -1 Ca 2+ 可以显著提高Chi8的酶活性,能够达到原酶活性的110.62%,而5 mmol-L -1Co 2+、Cu 2+对Chi8具有显著抑 制作用，与酶作用后分别下降到原酶活性的89.70%和60.17%o 尤其是添加5 mmol-L -1 Fe 3+时，酶活性下降到原来的5.93%o 从图3-C 可知:Chi8酶活性在pH6.0时达到最高,其中偏酸性条件抑制效应更明显, 在pH4.0时基本失去活性，而在pH9.0时仍保留了部分酶活性,可达到最高酶活性的50%o
(q ・I
i
・n}封
艇B -
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&
金属离子Metal ion B 0.64-a 0.56-0.48-士0.40-d 0.32-Fl
0.24-0.16
-0.08-CK Na Ca 2+ Fe 3+ （：o 2+ Cu 2+b b -Fl A
c ............o
5 4 3 2 1
04o 0 o
o.o O U I X Z U
IXI €
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L i ・n }s 艇魅c
■磷酸缓冲液 Phosphate buffer ；▲醋喩缓沛鮫 Acetic acid buffer ；• Tris-HC® 冲液 Tris-HCl buffer 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
pH 值 pH value
图3不同条件下Chi8酶活性的变化
Fig. 3 The changes of enzyme activity of Chi8 in different conditions
不同小写字母表示处理间差异显著（P <0.05）。

下同。

The different small letters indicated significant difference in treatments at 0.05 level. The same as
follows.
116南京农业大学学报第44卷
从图3-D 可知:在相同的热处理时间（40 min ）内，随着热处理温度的升高，酶活性显著降低。

在30、 37,40和43弋热处理条件下，相对于热处理温度升高对酶活性造成的显著影响，热处理时间增加对酶活 性影响相对较小,随着处理时间增加,酶活性基本不变;47弋热处理条件下,随处理时间增加,酶活性下降 明显;在50弋热处理条件下，在初始的20 min 内酶活性基本丧失。

因此，几丁质酶Chi8在30~43弋可以 保持较好的热稳定性;当温度高于47弋后蛋白迅速失活,酶活性受抑制，并且随着时间延长而更明显。

从图4可知:Chi8对胶体几丁质具有良好的分解效果，也能分解羧甲基壳聚糖,而基本没有分解几丁 质和壳聚糖的能力；延长反应时间对于底物降解效果并不显著。

因此,Chi8并不能直接降解几丁质，需要 对几丁质做预处理或者与其他几丁质酶协同作用才能实现对几丁质的分解与转化。

胶体几丁质 几丁质竣甲基壳聚糖壳聚糖
Colloidal chitin Chitin Carboxymethyl Chitosan 1312
11
IO,-b b E a
□ lh;□ 4h;□ lOh r
0^cd
chitosan 底物 Substrate 图4不同底物对Chi8比酶活性的影响
Fig. 4 The effect of different substrates on
specific enzyme activity of Chi8
2・4 Chi8降解胶体几丁质的水解产物鉴定
oolmpunqv &!卅150 200 250 300 350 400 450 500 550质荷比m/z 图5 Chi8降解胶体几丁质产物
Fig ・ 5 Degradation of colloidal chitin
products by Chi8为了阐明Chi8对胶体几丁质的催化特性，利用MALDI-TOE/MS 法对水解产物进行分析（图5）。

Chi8 水解胶体几丁质后形成了不同的多糖，降解产物中以几丁二糖［（G1c NA c ）2
】丰度最高，其丰度大于1 800； 除此之外，还检测到单糖。

这表明Chi8降解胶体几丁质的最终产物以低聚糖为主，尤其以几丁二糖为主。

2.5 Chi8的同源蛋白结构预测及底物模拟对接
Chi8的结构域和同源蛋白结构分析结果表明，其与GH18家族关系密切。

Chi8的结构具有较低的复 杂性,只含有1个Glyco-18结构域（17~368），E 值为5.53 e "143，其主要功能为结合胶体几丁质。

由图6-A 可知，Chi8蛋白同源结构模型由18个螺旋和15个0 -折叠组成,末端的1个免疫缺乏因子（immune defi ­ciency ，IMD ）残基为咪唑环,残基相对分子质量为69.08，广泛存在于748种蛋白结构中,包括5ZBJ 、3QK1、 4P8T 等蛋白。

蛋白与底物对接结果表明，有4个氨基酸残基与配体相互作用，同时还存在5个蛋白质配 体相互作用通道,主要以氢键和n 堆垛的形式相互作用（图6-B ）。

将几丁六糖模拟成活性物质与模拟的 Chi8三维结构进行对接，对接结果展示了该蛋白与几丁六糖结合的位点Asn197、Trp110、Tyr218、Arg274、 Arg31,这些位点可能为该蛋白的活性中心。

图6 Chi8的同源蛋白结构模型(A )及底物模拟对接(B )
Fig ・ 6 The homologous protein structure model (A ) and substrate simulation docking of Chi8 (B
)
第1期王小松，等:贵州木霉NJAU4742几丁质酶基因chi8的克隆、表达和酶学特性研究117
3讨论
几丁质及其衍生物在工业、农业,尤其是生物医药等方面具有巨大的应用前景，因此研究利用高活性几丁质酶产生壳聚糖具有重要意义。

GH18家族中大多数几丁质酶的结构域均包含1个碳水化合物结合模块(CBM54),同时还具备1个或多个几丁质酶催化域，如ChiW[18]和Tc-ChiD[19]的结构域中均包含1个SLH结构域。

TIM-barrel是GH18家族几丁质酶中常见的蛋白质结构，这一类蛋白是由1个半桶进化而来，每1个半桶自身不具备生物学功能,2个半桶合在一起共同作用才能发挥蛋白质的功能。

Chi8蛋白中 同样含有TIM-barrel结构，但是Chi8只有1个Glyco-18结构域用于结合底物，因此催化能力稍微偏低且不能直接分解几丁质和壳聚糖。

不同种类和来源的几丁质酶对酸碱适应性差异较大，通常最佳pH值范围为3.0~10.0[20-22],本研究中Chi8的最佳pH值约为6.0。

Wang等[23]从Pseudoalteromonas sp.DL-6获得1个非隐性内源性几丁质酶ChiA,其最佳pH值为9.0o不同几丁质酶的最适温度也有较大的差异，大部分几丁质酶在40~50V酶活性保持稳定,温度继续升高将会完全失去酶活性[7-9]。

本研究中，Chi8在30~40V具有很高的酶活性，且具有较好的热稳定性，当温度达到50V时基本失去活性，说明来源于NJAU4742的几丁质酶Chi8的热稳定性并不理想。

不同金属离子对几丁质酶Chi8的酶活性影响比较大,Co2+、Fe2+、Fe3+及Hg2+对大部分几丁质酶活性具有抑制作用，而Mg2+、Ca2+及Mn2+等具有增强作用[24]。

一般情况下，金属离子可能会影响蛋白分子结构的稳定性和多种酶的催化活性，几丁质酶和底物结合过程需要盐离子形成盐桥加以稳定;另外一些盐可以减轻蛋白表面的静电力，从而使蛋白不容易形成紊乱结构，降低蛋白不可逆失活的概率[25]o 几丁质酶水解胶体几丁质后可产生不同的壳寡糖，Suginta等[26]检测到水解产物中从GlcNAc到(GlcNAch都有分布,其中以(GlcNAc)和(GlcNAc)4为主，并且随反应时间延长,水解产物呈现(GlcNAc)?增加的趋势，说明(GlcNAc)。

可以进一步被降解。

本研究中，Chi8水解胶体几丁质的产物只检测到(GlcNAc)和单糖,Ueda等[27]也获得了相似的结果。

这主要是因为几丁质酶在水解几丁质多聚物时随着反应时间延长,水解产物逐渐由几丁多糖转化为几丁二糖并不断累积。

目前，关于几丁质酶的研究较多，但由于几丁质酶的多样性和复杂性，再加上自然界分泌的几丁质酶活性低等因素，导致几丁质酶的工业化生产还存在较多的问题。

另外，国内对于几丁质酶在农业、医药等领域的研究起步晚,对于几丁质酶在抗虫、抗菌中的具体机制至今尚未明确，亟需更深入的研究。

随着几丁质酶理论基础和应用研究日益受到重视，几丁质酶的研究已成为糖化学催化领域中不可忽视的分支，在环境、医药、农业等领域具有十分广阔的应用前景。

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