DNA复制
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当loop被DnaB（解旋酶）打开，在DnaT辅助下 在复制叉处形成 DnaB6•DnaC6•ATP6 DnaB继续解旋，增大解旋的空间， SSB结合到ssDNA上防止退火（Annealing）
拓扑异构酶II在复制叉的上方作用，用来减轻 下方DnaB解旋的压力
The Klenow fragment is the large portion after
cleaving off the 5'-3' exonuclease and has been
used as a polymerase in lab work.
47
Klenow 片段
Klenow fragment
39
拓扑异构酶 Topoisomerase
自然状态下DNA为负超螺旋
拓扑异构酶I用来移除负超螺旋 （热力学过程）
拓扑异构酶II用来增加负超螺旋 （消耗ATP）
过程都是a.剪断DNA链b.重新缠绕 c.封口
不同： I.不需ATP，剪断单链 II.需要ATP，剪断双链
相同： 活性中心为Tyr
拓扑异构酶 I
5’
3’
3’
5’
34
35
冈崎片段 Okazaki fragment
5’ 3’
3’ 5’
36
37
DNA聚合酶III DNA polymerase III DNA聚合酶I DNA polymerase I DNA连接酶 DNA ligase
38
问题： 为什么是5’-3’方向合成？ 为什么要用RNA作为起始模板？ 如何保证复制的忠实性？
25
DNA的复制方式： 全保留复制 Conservative model
半保留复制 Semiconservative model
弥散复制 Dispersive model
26
半保留复制证明实验
1958 Meselson和Stanl实验----原核生物 Taylor 植物根尖细胞染色体放射性实验----真核生物
解旋酶 Helicases
单链结合蛋白（SSB） Single- strand binding proteins
引物 Primer
引发酶
Primase
32
DNA聚合酶 DNA polymerase 模板链 Template strand
33
先导链 Leading strand 后随链 Lagging strand
目录
1
Section 1. 介绍（Introduction）
现代生物学的三大基石： 1838-1839年 细胞学说 1859年 达尔文进化论 1866年 孟德尔遗传学
施莱登
施旺
达尔文
孟德尔
2
生物化学的三大阶段： 1890-1930年 生命的分子基础 1930-1950年 生物的氧化和代谢 1950年- 生命的遗传信息流动
又名DNA聚合酶I大片段
汉斯·克列诺于1970年用枯 草杆菌蛋白酶（subtilisin） 处理大肠杆菌DNA聚合酶 Ⅰ时，得到的两个片段中 分子量较大的一个。
C末端605个氨基酸残基片段 保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚 合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺 少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。 用于cDNA第二链合成，双链 DNA3ˊ-末端的标记 粘性末端的单链补齐成为平头
52
复制起始位点（Ori） Origins of replication 大肠杆菌的复制起始点 命名为OriC
245 bp 的高度保守序列 在5’端有3个富含AT的序列（2个氢键1bp） 在右边有5个9bp的序列，用来绑定DnaA（起始因子）
53
例子：大肠杆菌的DNA复制 DnaA消耗ATP绑定在9bp的序列，诱导打开AT富集区域 HU蛋白（组蛋白类似物）防止DnaA绑定OriC以外的序列
Function
Unwinding DNA Single-stranded DNA binding Initiation factor Histone-like (DNA binding and bending) Primosome assembly Primosome assembly Primosome assembly DNA unwinding (helicase) DnaB chaperone Assists DnaC in delivery of DnaB Synthesis of an RNA primer Elongation (DNA synthesis) Excises RNA primer, fills in with DNA Covalently links Okazaki fragments Termination
12
1961年 Francois Jacob 和Sydney Brenner 发现核糖体是翻译必须的。 不同的mRNA在核糖体作用下会生成不同的蛋白。
13
1960s Marshall Nirenberg；Gobind Khorana；Robert W. Holley 对遗传密码子 及蛋白合成的功能进行了研究。
Marshall Nirenberg
Gobind Khorana
Robert W. Holley
14
1970. Howard Temin；David Baltimore 发现了逆转录
Howard Temin
David Baltimore
15
1983. Barbara McClintock 在1948年的转座现象被授予诺贝尔奖 DNA transposable element
DNA Pol I was the first polymerase isolated. This was obtained from E.coli by Arthur Kornberg and is known as the Kornberg enzyme.
This enzyme has a 5'-3' exonuclease activity that cleaves RNA primers, a 5'-3' polymerase activity that makes DNA and a 3'-5' exonuclease activity that repairs DNA.
22
为什么会想到Purine和Pyrimidine的配对？
Rosalind Franklin的结晶数据，3.4nm的距离 如何解释Chargaff’s 规则
23
Section 3. 基于DNA的DNA复制
24
DNA复制的一般特征： 半保留复制 作为模板的DNA需要解旋 以原先DNA作为模版，需要4种dNTP，Mg2+ 需要引物 复制方向始终是5’-3’ 具有固定的复制起点 多数为双向复制，少数为单向 半不连续性 高度的忠实性
40
拓扑异构酶I作用机理
41
42
细菌的拓扑异构酶II作为抗生素的靶点
人拓扑异构酶I作为抗肿瘤药物的靶点 Camptothecin
43
DNA解旋酶 DNA Helicases DNA解旋酶需要ATP
44
DNA聚合酶 DNA polymerase
45
Replication Comparison
48
DNA Polymerase Ac源自ivity 两个镁离子绑定在活性中心
49
分子形状vs 氢键 Both of these direct thymine into a DNA strand even though the one cannot form H-bonds.
50
构象的变化 When the correct dNTP binds a change occurs resulting in a tight fit for the proper dNTP shape.
27
28
DNA复制的起始：
DNA的类型
线性超螺旋
环状超螺旋
环状负超螺旋
29
原核生物的DNA复制 环状DNA 一个复制起始位点
30
真核生物的DNA复制 线状DNA 多个复制起始位点
31
拓扑异构酶 Topoisomerase
复制起始位点（Ori） Origins of replication
复制叉 Replication fork
1961年雅各布和莫诺提出了操纵子的概念。 解释了原核基因表达的调控。
比德尔
塔特姆
沃森
克里克
雅各布
莫诺
4
核心：中心法则 （Central Dogma）
5
1869年 Miescher 发现了核酸及核酸的主要成分是DNA。
Miescher
6
1928年 Frederick Griffith 肺炎球菌转化试验。证明有转化因子的存在。
DNA的复制，修复和重组 DNA Replication，Repair， and Recombination
宋潇达 2016.05
• Section 1. 引言 • Section 2. 本章背景 • Section 3. 基于DNA的DNA复制 • Section 4. DNA的损伤及修复 • Section 5. 基于RNA的DNA的复制 • Section 6. DNA的重组
51
Proteins Involved in DNA Replication in E. coli
Protein Name
DNA Gyrase SSB DnaA HU PriA PriB PriC DnaB DnaC DnaT Primase DNAP III holoenzyme DNAP I Ligase Tus
生物化学 （Biochemistry）
遗传学 （Genetics）
分子生物学
（Molecular Biology）
3
分子生物学三大基石及简史： 1941年比德尔和塔特姆提出了“一个基因，一个酶”学说。 基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。
1953年沃森和克里克提出了DNA的反向平行双螺旋结构。 提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。
Barbara McClintock
16
The Nobel Prize in Chemistry 1989 ：Altman和Cech的核酶的发现（1981）
Sidney Altman
Thomas R. Cech
"for their discovery of catalytic properties of RNA Ribozyme"
17
The Nobel Prize in Chemistry 1993 Mullis的聚合酶链式反应扩增DNA "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"
Kary B. Mullis
18
1997，The Nobel Prize in Physiology or Medicine 朊蛋白的发现
比德尔
塔特姆
9
1951年 X~ray photograph of DNA with high quality
M. H. F. Wilkins
10
1951年 James Watson和Francis Crick 提出DNA双螺旋结构。
11
1958，Matthew Meselson and Franklin Stahl 证明在细菌中DNA的复制是半 保留复制。
speed Okazaki primer ori sites Pol
Procaryotic 1000 b/sec 1000 b ~30 b single nuclease
Eucaryotic 50 b/sec 100-200 b ~3-5 b multiple no nuclease
46
DNA Polymerase I
Stanley B. Prusiner "for his discovery of Prions – a new biological principle of infection"
19
Section 2. 本章背景
DNA单链的结构
20
DNA双螺旋结构
DNA双螺旋化学结构
21
Watson-Crick model：
Frederick Griffith
7
1944年 Oswald Avery 体外肺炎双球菌转化，噬菌体侵染试验。证实了遗传 物质是DNA而不是蛋白质。
8
1941年 比德尔同塔特姆合作链孢菌实验。比德尔和塔特姆认为：所有生物 体内的一切生物化学过程最终都由基因控制;这些过程都可细分为一系列化 学反应;各个反应均以某种方式受单个基因的控制;单个基因的突变只能改变 细胞进行某一化学反应的能力。
拓扑异构酶II在复制叉的上方作用，用来减轻 下方DnaB解旋的压力
The Klenow fragment is the large portion after
cleaving off the 5'-3' exonuclease and has been
used as a polymerase in lab work.
47
Klenow 片段
Klenow fragment
39
拓扑异构酶 Topoisomerase
自然状态下DNA为负超螺旋
拓扑异构酶I用来移除负超螺旋 （热力学过程）
拓扑异构酶II用来增加负超螺旋 （消耗ATP）
过程都是a.剪断DNA链b.重新缠绕 c.封口
不同： I.不需ATP，剪断单链 II.需要ATP，剪断双链
相同： 活性中心为Tyr
拓扑异构酶 I
5’
3’
3’
5’
34
35
冈崎片段 Okazaki fragment
5’ 3’
3’ 5’
36
37
DNA聚合酶III DNA polymerase III DNA聚合酶I DNA polymerase I DNA连接酶 DNA ligase
38
问题： 为什么是5’-3’方向合成？ 为什么要用RNA作为起始模板？ 如何保证复制的忠实性？
25
DNA的复制方式： 全保留复制 Conservative model
半保留复制 Semiconservative model
弥散复制 Dispersive model
26
半保留复制证明实验
1958 Meselson和Stanl实验----原核生物 Taylor 植物根尖细胞染色体放射性实验----真核生物
解旋酶 Helicases
单链结合蛋白（SSB） Single- strand binding proteins
引物 Primer
引发酶
Primase
32
DNA聚合酶 DNA polymerase 模板链 Template strand
33
先导链 Leading strand 后随链 Lagging strand
目录
1
Section 1. 介绍（Introduction）
现代生物学的三大基石： 1838-1839年 细胞学说 1859年 达尔文进化论 1866年 孟德尔遗传学
施莱登
施旺
达尔文
孟德尔
2
生物化学的三大阶段： 1890-1930年 生命的分子基础 1930-1950年 生物的氧化和代谢 1950年- 生命的遗传信息流动
又名DNA聚合酶I大片段
汉斯·克列诺于1970年用枯 草杆菌蛋白酶（subtilisin） 处理大肠杆菌DNA聚合酶 Ⅰ时，得到的两个片段中 分子量较大的一个。
C末端605个氨基酸残基片段 保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚 合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺 少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。 用于cDNA第二链合成，双链 DNA3ˊ-末端的标记 粘性末端的单链补齐成为平头
52
复制起始位点（Ori） Origins of replication 大肠杆菌的复制起始点 命名为OriC
245 bp 的高度保守序列 在5’端有3个富含AT的序列（2个氢键1bp） 在右边有5个9bp的序列，用来绑定DnaA（起始因子）
53
例子：大肠杆菌的DNA复制 DnaA消耗ATP绑定在9bp的序列，诱导打开AT富集区域 HU蛋白（组蛋白类似物）防止DnaA绑定OriC以外的序列
Function
Unwinding DNA Single-stranded DNA binding Initiation factor Histone-like (DNA binding and bending) Primosome assembly Primosome assembly Primosome assembly DNA unwinding (helicase) DnaB chaperone Assists DnaC in delivery of DnaB Synthesis of an RNA primer Elongation (DNA synthesis) Excises RNA primer, fills in with DNA Covalently links Okazaki fragments Termination
12
1961年 Francois Jacob 和Sydney Brenner 发现核糖体是翻译必须的。 不同的mRNA在核糖体作用下会生成不同的蛋白。
13
1960s Marshall Nirenberg；Gobind Khorana；Robert W. Holley 对遗传密码子 及蛋白合成的功能进行了研究。
Marshall Nirenberg
Gobind Khorana
Robert W. Holley
14
1970. Howard Temin；David Baltimore 发现了逆转录
Howard Temin
David Baltimore
15
1983. Barbara McClintock 在1948年的转座现象被授予诺贝尔奖 DNA transposable element
DNA Pol I was the first polymerase isolated. This was obtained from E.coli by Arthur Kornberg and is known as the Kornberg enzyme.
This enzyme has a 5'-3' exonuclease activity that cleaves RNA primers, a 5'-3' polymerase activity that makes DNA and a 3'-5' exonuclease activity that repairs DNA.
22
为什么会想到Purine和Pyrimidine的配对？
Rosalind Franklin的结晶数据，3.4nm的距离 如何解释Chargaff’s 规则
23
Section 3. 基于DNA的DNA复制
24
DNA复制的一般特征： 半保留复制 作为模板的DNA需要解旋 以原先DNA作为模版，需要4种dNTP，Mg2+ 需要引物 复制方向始终是5’-3’ 具有固定的复制起点 多数为双向复制，少数为单向 半不连续性 高度的忠实性
40
拓扑异构酶I作用机理
41
42
细菌的拓扑异构酶II作为抗生素的靶点
人拓扑异构酶I作为抗肿瘤药物的靶点 Camptothecin
43
DNA解旋酶 DNA Helicases DNA解旋酶需要ATP
44
DNA聚合酶 DNA polymerase
45
Replication Comparison
48
DNA Polymerase Ac源自ivity 两个镁离子绑定在活性中心
49
分子形状vs 氢键 Both of these direct thymine into a DNA strand even though the one cannot form H-bonds.
50
构象的变化 When the correct dNTP binds a change occurs resulting in a tight fit for the proper dNTP shape.
27
28
DNA复制的起始：
DNA的类型
线性超螺旋
环状超螺旋
环状负超螺旋
29
原核生物的DNA复制 环状DNA 一个复制起始位点
30
真核生物的DNA复制 线状DNA 多个复制起始位点
31
拓扑异构酶 Topoisomerase
复制起始位点（Ori） Origins of replication
复制叉 Replication fork
1961年雅各布和莫诺提出了操纵子的概念。 解释了原核基因表达的调控。
比德尔
塔特姆
沃森
克里克
雅各布
莫诺
4
核心：中心法则 （Central Dogma）
5
1869年 Miescher 发现了核酸及核酸的主要成分是DNA。
Miescher
6
1928年 Frederick Griffith 肺炎球菌转化试验。证明有转化因子的存在。
DNA的复制，修复和重组 DNA Replication，Repair， and Recombination
宋潇达 2016.05
• Section 1. 引言 • Section 2. 本章背景 • Section 3. 基于DNA的DNA复制 • Section 4. DNA的损伤及修复 • Section 5. 基于RNA的DNA的复制 • Section 6. DNA的重组
51
Proteins Involved in DNA Replication in E. coli
Protein Name
DNA Gyrase SSB DnaA HU PriA PriB PriC DnaB DnaC DnaT Primase DNAP III holoenzyme DNAP I Ligase Tus
生物化学 （Biochemistry）
遗传学 （Genetics）
分子生物学
（Molecular Biology）
3
分子生物学三大基石及简史： 1941年比德尔和塔特姆提出了“一个基因，一个酶”学说。 基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。
1953年沃森和克里克提出了DNA的反向平行双螺旋结构。 提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。
Barbara McClintock
16
The Nobel Prize in Chemistry 1989 ：Altman和Cech的核酶的发现（1981）
Sidney Altman
Thomas R. Cech
"for their discovery of catalytic properties of RNA Ribozyme"
17
The Nobel Prize in Chemistry 1993 Mullis的聚合酶链式反应扩增DNA "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"
Kary B. Mullis
18
1997，The Nobel Prize in Physiology or Medicine 朊蛋白的发现
比德尔
塔特姆
9
1951年 X~ray photograph of DNA with high quality
M. H. F. Wilkins
10
1951年 James Watson和Francis Crick 提出DNA双螺旋结构。
11
1958，Matthew Meselson and Franklin Stahl 证明在细菌中DNA的复制是半 保留复制。
speed Okazaki primer ori sites Pol
Procaryotic 1000 b/sec 1000 b ~30 b single nuclease
Eucaryotic 50 b/sec 100-200 b ~3-5 b multiple no nuclease
46
DNA Polymerase I
Stanley B. Prusiner "for his discovery of Prions – a new biological principle of infection"
19
Section 2. 本章背景
DNA单链的结构
20
DNA双螺旋结构
DNA双螺旋化学结构
21
Watson-Crick model：
Frederick Griffith
7
1944年 Oswald Avery 体外肺炎双球菌转化，噬菌体侵染试验。证实了遗传 物质是DNA而不是蛋白质。
8
1941年 比德尔同塔特姆合作链孢菌实验。比德尔和塔特姆认为：所有生物 体内的一切生物化学过程最终都由基因控制;这些过程都可细分为一系列化 学反应;各个反应均以某种方式受单个基因的控制;单个基因的突变只能改变 细胞进行某一化学反应的能力。