胚胎干细胞的培养

胚胎干细胞的体外培养
胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。

全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。

胚胎干细胞能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。

胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。

由于其具有全能性,故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。

例如在培养液中加入不同的分化因子,可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞,甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞,或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶,经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内,并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。

从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。

由于胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。

目前, 由于小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，本文将以此为例，较详细地介绍胚胎干细胞体外分离培养和鉴定等实验技术。

一、胚胎干细胞体外培养原理
胚胎干细胞体外培养的原则是: 在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。

胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。

目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。

有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feeder layer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。

MEF 和STO都能分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制胚胎干细胞自主分化的因子。

MEF和STO培养上清中抑制胚胎干细胞自主分化因子--白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor；LIF）含量在500～1000IU/ml （分泌型）,同时在MEF和STO基质上还存在LIF（基质型）。

无饲养层培养法则是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，或在基础培养基中加入重组的LIF制备成条件培养基。

如果使用这样的条件培养基培养小鼠胚胎干细胞，可以不使用饲养层细胞，能保证小鼠胚胎干细胞增殖的同时维持未分化二倍体状态。

二、胚胎干细胞的分离与培养
(一)饲养细胞的培养
饲养细胞是指与胚胎干细胞共培养时能促进其增殖和抑制其自主分化的细胞。

1、主要实验材料
（1）细胞可作为饲养层的细胞有二类: 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞。

（2）培养液DMEM(葡萄糖1.0g/L), 添加10%小牛血清(NBS)、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml。

（3）消化液0.25% 胰蛋白酶以1:1比例加入0.02% EDTA。

（4）小鼠周龄为7～8wk的性成熟母小鼠和周龄为8wk的种公鼠。

2. 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养
（1）小鼠胚胎的准备
1)性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。

2)每天早上观察母小鼠阴道口。

有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。

见栓当
为怀孕的0.5d。

3)取怀孕12.5～14.5d母鼠,断颈处死，无菌条件下暴露子宫。

4)用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。

5)取出整个子宫,在无菌滤纸上吸干血迹,置于有PBS或无血清DMEM平皿内。

用PBS洗涤三次,弃除表
面残余血迹。

6)沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,充分洗涤,弃
除表面红细胞。

7)用小镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PBS洗涤三次。

8)去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,用PBS 至少洗涤三次,充分弃除红细胞。

（2）小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养
培养方法有两种: 组织块培养法和单细胞悬液培养法。

组织块培养法：
1) 用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块,吸置于离心管内。

2) 室温下静置5～10min, 弃上层液，留下胚胎组织碎块。

3) 向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入1ml消化液,轻轻吹吸30sec。

4) 加入等体积的培养液终止消化。

室温下静止5-10min。

5) 弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物。

6）加入5ml培养液重新悬浮鼠胚组织块,移入培养瓶内。

每5个鼠胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。

7) 补加适量的培养液,使组织块悬浮液能均匀分布于培养瓶表面。

37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培
养。

8) 培养开始的前两天不要晃动培养瓶。

第三天见组织块附着培养瓶表面, 周围生长出细胞。

补充培养
液或更换培养液,继续培养。

每天观察。

9) 待细胞连成一片时,即可消化。

消化时弃培养液,用PBS洗涤一次；加适量消化液（以能覆盖细胞层
为度)，在室温下作用大约30sec；弃消化液，让残余消化液继续作用。

轻敲培养瓶底, 当细胞层
出现裂隙时，加入培养液终止消化。

或在倒置显微镜下观察，当细胞与细胞之间分开即可终止消化。

10) 补加培养液，轻轻吹打均匀，吸置离心管内，静置5～10min。

11) 上层为单细胞悬液,下层为组织块沉淀。

将上层单细胞悬液轻轻吸置另一离心管内,弃组织块。

12）以800～1000rpm 5min离心，弃上清。

加入培养液,重新悬浮细胞沉淀。

以1:3比例传代。

采用3～
5代细胞作为饲养细胞。

单细胞悬液培养法：
1)～5）步骤同组织块培养法1)～5) 步骤。

6)重复组织块培养法3）～4）步骤5～6次,即重复消化鼠胚组织块5～6次。

每次消化后都
即单细胞悬液。

最后一次消化后弃组织块。

７)将收集到的单细胞悬液离心，800～1000rpm 5min。

８)弃上清,加入培养液,轻轻吹吸,制备成均匀的单细胞悬液。

9) 移置培养瓶内。

5个鼠胚制备出来的单细胞悬液可以使用3个100ml的培养瓶。

10)补加适量的培养液，吹吸均匀。

37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。

每天观察。

11)培养2～3d后,细胞连成片,即可消化。

消化过程同组织块培养法９)步骤。

12)以1:2～1:3比例传代培养,2～3d传一代。

采用3～5代细胞作为饲养细胞。

（3）培养结果
在培养MEF初始的1～2代时,杂细胞（非成纤维细胞的其他组织细胞）较多,细胞形态多样；在第三代开始时,杂细胞逐渐减少。

小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时,由于受杂细胞的影响,形态不够典型。

3.STO细胞的培养
STO 细胞是已建系的细胞,故可按一般已建系的细胞培养方法培养。

4.讨论
使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养细胞培养胚胎干细胞是一种最早和常用的方法。

MEF能产生抑制胚胎干细胞自主分化和促进胚胎干细胞增殖的因子,故它能有效地促进胚胎干细胞增殖并维持其未分化二倍体状态和全能性。

但使用MEF有如下几方面的缺点: ①MEF 生命期有限,不能在体外长期传代。

在体外传代时间太长，其产生促增殖因子和抑制分化因子的能力会减弱甚至丧失。

最好使用第3～5代MEF, 因为第3～5代的MEF生长和各种因子分泌都旺盛,杂细胞也较少。

这就需要经常准备12.5～14.5d怀孕小鼠制备MEF。

②MEF 不具有耐药性,不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。

③在胚胎干细胞培养过程中,死亡的MEF细胞的染色体释出可能会引起胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。

④不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。

⑤种植胚胎干细胞前,如果用丝裂霉素-C处理MEF,清洗不彻底时,残余的丝裂霉素-C会影响胚胎干细胞的增殖。

STO 细胞是已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌本苷亚系（Hogan et al.1994）。

它可以长期进行体外培养传代和冻存。

同MEF一样,它能分泌促胚胎干细胞增殖及抑制细胞自主分化的因子,但效果不如MEF。

作为饲养细胞使用时,常要在培养液中加入抑制胚胎干细胞自主分化的因子(如白血病抑制因子,LIF)。

目前，已有转染了neor抗性基因和LIF基因的STO细胞,如SNL细胞,它能分泌足够量的LIF抑制胚胎干细胞的分化,而不需要在培养液中添加LIF；又因它带有neor抗性基因,故可以用于转基因胚胎干细胞的筛选。

使用STO和SNL细胞作为饲养细胞,免去了准备怀孕母小鼠的繁琐工作,但它仍有MEF ③～⑤项的不足。

在MEF和STO细胞(包括SNL细胞)培养时,用DMEM加10%小牛血清作为培养液即可。

在MEF培养过程中，培养液的营养不需过高,例如不需要另外添加谷氨酰胺；如培养液营养过高,杂细胞容易生长,MEF不易纯化。

可用各种品系的小鼠来制备MEF,但以胎数多为好。

胎数最多的小鼠品系是远交系和杂交第一代(F1)小鼠。

可一次大量培养MEF以及进行冻存,用时再解冻培养, 但效果不如新鲜制备的MEF。

（二）饲养单层的制备
一定剂量的丝裂霉素-C(mitomycin-C)和γ-射线能够使细胞停止分裂，但不至于马上死亡，可在体外存活一段时间，并保持分泌各种因子的功能。

故使用丝裂霉素-C或γ-射线处理饲养细胞，使之终止分裂，同时仍分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制其自主分化的因子，维持其未分化二倍体状态。

1.主要实验材料
（1）丝裂霉素-C 丝裂霉素-C 2mg溶解于4ml的PBS中，配制成o.5mg/ml的母液；4℃避光保存。

使用前，用饲养细胞培养液配成终浓度为10ug/ml。

稀释后4℃保存，不超过1wk。

（2）0.1%明胶水溶液明胶0.1g，超纯水或五蒸水100ml。

稍加热溶解后高压灭菌45min。

4℃保存
备用。

2. 制备过程
1）当第3～5代小鼠胚胎成纤维细胞或STO细胞生长连成一片时，在培养上清中加入丝裂霉素-C，使
终浓度为10ug/ml，放回培养箱作用2～３hr。

或用γ－射线照射,照射量为3000～10000rad。

2）用明胶预先处理培养瓶（皿）。

处理方法是：将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶（皿）内，以能覆盖培
养瓶（皿）表面即可，在室温下静置2hr以上。

使用前，吸弃多余的明胶水溶液，用PBS 洗涤一次。

3）弃含有丝裂霉素－C的饲养细胞培养上清。

用PBS洗涤五次；若用γ－射线处理，则省去用PBS洗涤。

4) 消化饲养细胞。

用培养液制备成３×１０５个／ml密度的细胞悬液，种植到预先用明胶处理过的
培养瓶(皿)内。

种植的细胞数为：MEF 7.5×104～1×105个／cm2, STO 5×104个／cm2。

5）在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。

6）待细胞贴壁后进行观察，若发现细胞过稀，补加处理过的细胞，以保证细胞能连成一片而没有间隙。

7）将制备好的饲养单层放置在培养箱内备用。

在5d内使用，使用前要更换胚胎干细胞培养液。

3.结果
好的饲养单层应该是: 细胞连成一片，无间隙，死亡的细胞和杂细胞（非成纤维细胞的其他组织细胞）
极少。

4．讨论
在饲养细胞生长连成一片时,如果细胞层较薄,丝裂霉素-C处理的时间可缩短为30min 至1.5hr。

制备的饲养单层最好是无间隙, 因为MEF 和STO细胞产生的抑制分化因子一部分分泌到培养上清中，还有一部分会锚定在细胞外基质上, 通过与胚胎干细胞的接触而起到作用。

无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养细胞接触而达到最佳效果。

有报道（田小利等1994），制备好的单层可在6～10d内使用，但本文作者的经验是5d内使用效果最佳。

时间过长，处理后的饲养细胞会衰退死亡，效果下降，以致影响胚胎干细胞的生长。

（三）条件培养基的制备
1.主要实验材料
（1）白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）。

（2）细胞株Buffalo大鼠肝细胞株BRL。

（3）心肌细胞用周龄为2～3wk大鼠的心肌组织制备。

2.制备方法
（1）白血病抑制因子条件培养基的准备在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使终浓度为
1000IU/ml。

（2）Buffalo大鼠肝细胞株BRL条件培养基（BRL-CM）的准备
1）消化对数生长期的BRL细胞，用胚胎干细胞培养液调细胞浓度为2×105个/ml, 以5～8×104/cm2 密
度种植到培养瓶内。

2）在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养72hr，收集培养上清。

3）培养上清先以1000rpm 10min离心弃细胞碎片，然后用φ0.22um滤膜过滤。

冰冻保存备用。

4）使用前以6～7份培养上清加3～4份新鲜的胚胎干细胞培养液，再添加8～10%胎牛血清，组合成
BRL-CM。

（3）大鼠心肌细胞条件培养基(RH-CM)的制备
1) 将周龄为2～3wk的大鼠断颈处死，无菌条件下取得心肌，剪碎成1mm3的组织小块，加胚胎干细胞
培养液作组织块培养。

2）在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养1wk。

每天观察。

3）组织小块会向周围长出细胞，当细胞连成一片时,消化传代, 制成单层培养物，记为第一代。

5）收集1～6代培养上清，先以1000rpm 10min离心弃细胞碎片，然后用φ0.22um滤膜过滤。

冰冻保
存备用。

5）使用前以6份培养上清加3份新鲜胚胎干细胞培养液和1份胎牛血清组合成RH-CM。

3. 结果
获得三种条件培养基。

4. 讨论
白血病抑制因子（LIF）是六十年代末发现的一种多功能细胞因子。

在体外具有诱导M1细胞（一种髓样白血病细胞，myeloid leukaemic cell）向正常分化（Williams et al. 1988, 张炜1998）和抑制胚胎干细胞自主分化能力，以及能够促进8细胞期以后的桑椹胚至着床前胚胎的发育，提高囊胚的存活率，促进滋胚层细胞增殖和内细胞团生长。

许多组织和细胞都有LIF和LIF受体的表达，如子宫内膜、蜕膜、胚胎滋胚层细胞、胚胎成纤维细胞、人膀胱癌细胞等有LIF的表达；胚胎干细胞、M1髓样白血病细胞、巨噬细胞、胚胎瘤（癌）细胞、脂肪细胞、神经细胞等有LIF受体的表达。

LIF分为两种类型：分泌型（D型）和基质型（M 型）。

D型可分泌到细胞外液中，M型则锚定到细胞外基质上。

人和鼠LIF基因有78%～94%的同源性。

有用人LIF培养小鼠胚胎干细胞抑制其分化的报道（Williams et al. 1988），但未见有用鼠LIF培养人胚胎干细胞的报道。

目前，有重组的LIF商品，可用来制备LIF条件培养基。

LIF最适用量为1000IU/ml(Pease et al. 1990)。

当LIF浓度降至50～100单位/ml时，胚胎干细胞未分化的克隆数会下降至50%～60%。

Buffalo大鼠肝细胞株BRL 能分泌一种抑制畸胎癌(瘤)和胚胎干细胞自主分化的因子（differentiation inhibiting factor, DIF）,其结构与LIF相似。

用BRL细胞培养上清制备条件培养基，同样可以达到LIF条件培养基的作用(Simth et al. 1987)，且远比后者经济。

周龄为2～3wk大鼠心肌细胞也能分泌抑制胚胎干细胞分化的因子，但是否与LIF的结构相同，未见有报道。

有研究表明(韩嵘等1997)，大鼠心肌条件培养基不仅具有与LIF条件培养基相同的功能，还能显著地促进胚胎干细胞贴壁和生长，这一作用是LIF条件培养基所不能比拟的。

目前, 还发现许多细胞可以用来制备条件培养基，如人膀胱癌细胞5637株、小鼠畸胎瘤PSA-1株和T-3株等。

不使用饲养层细胞而使用条件培养基培养胚胎干细胞是一种趋势。

它免除了使用饲养层细胞的所有缺点。

但目前除了小鼠胚胎干细胞不使用饲养层细胞而单纯使用条件培养基分离培养成功外，大动物如猪、牛、兔以及灵长类动物如猴、人的胚胎干细胞单纯条件培养基分离培养未获成功(Thomson et al.1998)。

（四）胚胎干细胞的分离与培养
1. 主要实验材料
（1）培养液DMEM(葡萄糖4.5g/L)、NaHCO3 2.2g/L、Hepes 2g/L。

用超纯水或五蒸水溶解,过滤除菌。

在4℃保存备用。

使用前添加15%胎牛血清(FCS)、0.1mMβ–琉基乙醇(β-ME)或0.15mM单硫甘油(monothioglycerol)、2mM L-谷氨酰胺、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml(可用庆大霉素代替青、链霉素,用量为50μg/ml)。

（2）消化液胰蛋白酶干粉2.5g、EDTA 0.4g、Na Cl 7.0g、Na2HPO4.12H20 0.24g、KH2PO4 0.24g、KCl 0.37g、Tris 3.0g或Hepes 2.0g、D-葡萄糖1.0g、酚红10mg、超纯水或五蒸水1000ml，摇匀，4℃过夜，充分溶解，用1N HCl调pH值至7.6。

过滤除菌。

分装后在-10℃～-30℃冻存备用。

（3）冲卵液无Ca++ /Mg++ PBS, 添加10%小牛血清，青霉素100IU/ml，链霉素100IU/ml。

（4）孕马血清促性腺激素(pregnant mare’s serum gonadotropin,PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gomadotropin,HCG) 用单蒸水分别配制PMSG 50IU/ml，HCG 100IU/ml，在-20℃～-30 ℃保存备用。

（5）PBS NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.89g、KH2PO4 0.2g、超纯水或五蒸水1000ml，高压灭菌或过滤除菌。

在室温保存备用。

（6）链霉蛋白酶（pronase）用生理盐水或PBS配制成0.5%浓度溶液，于-10℃～-30℃保存备用。

（7）兔抗小鼠脾脏细胞抗血清用前以培养液作1：2000倍稀释。

（8）新鲜豚鼠血清用前以培养液作1：6倍稀释。

（9）性成熟前期母小鼠昆明小鼠大约周龄为4wk,体重为24～26g；C57小鼠日龄为25d，体重为12.5～
14g 。

2. 胚胎的准备和培养
（1）母小鼠超数排卵
1）性成熟前期母小鼠于中午12：00～1：00或下午5：00～6：00腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）,
每只小鼠5～10IU。

2）隔46～48hr腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），每只鼠5～10IU。

同时以1：1比例与公鼠合笼。

3）第二天上午观察母小鼠阴道栓，见栓当天上午确定为怀孕0.5d，见栓第四天为怀孕3.5d。

（2）胚胎采集
1）断颈处死怀孕3.5d的母小鼠,在无菌条件下打开腹腔,暴露子宫。

2）镊住近子宫颈端并剪断,分离子宫系膜,在输卵管端剪断子宫角。

3）取出子宫,在无菌滤纸上吸干血迹,置入无菌平皿内。

4）用1ml无菌注射器吸入冲卵液。

从子宫角端进针，保证针头进入子宫腔内，将冲卵液快速推入子宫
腔。

每侧子宫注入冲卵液0.2～0.5ml, 冲卵液会将胚胎冲出。

5）将毛细吸管在火焰上拉细，并用砂轮断末端，制备吸卵针。

6）将盛有胚胎和冲卵液的平皿置于50～100倍的解剖显微镜下。

用吸卵针收集胚胎。

3.5d
胚胎一般处于囊胚期，但也可能处于桑椹期，均可使用。

（3）胚胎培养
1）取φ3.5cm平皿,用记号笔划分四等分。

在每等分内加入胚胎干细胞培养液做成露滴状液滴,每个液
滴直径为0.5～1cm。

2）向平皿内加入透明石蜡油，以能覆盖培养液滴为度。

3）将收集好的3.5d胚胎吸置培养液滴内。

37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。

每天半量换液一次。

3、胚胎干细胞的分离
（1）普通分离方法
1）将囊腔充分扩展的胚胎移置到制备好的饲养单层上，换上胚胎干细胞培养液；或移置到无饲养层但加有条件培养基的液滴内（制备同前）。

2）继续培养。

第一天胚胎突破透明带；48hr左右胚胎贴壁，滋胚层细胞舒展开并贴附着培养瓶（皿）表面生长，内细胞团（inner cell mass，ICM）位于滋胚层细胞层的中央部位，向上隆起生长。

3）继续培养2～4d，内细胞团继续增大。

4）将毛细吸管一端在火焰上拉细，用砂轮将末端切断。

准备末端口径比内细胞团稍大和稍小两种。

5）取φ3.5cm的平皿，在平皿内做消化液小滴。

每个消化液小滴φ0.3～0.5cm。

每个平皿可做20个
消化液小滴。

6）将内细胞团生长良好的培养平皿置于解剖镜下或显微操作仪下，用50～100倍观察并完成7)～9)
的操作步骤。

7）用末端口径比内细胞团块稍大的毛细吸管挑起内细胞团，吸置消化液小滴内。

8）将内细胞团吸至另一消化液小滴，在室温或37℃下作用约1～5min。

改用末端口径比内细胞团小
的毛细吸管，轻轻吸吹内细胞团块，使之分散至3～4个细胞在一起的小团块。

9）将分散的内细胞团小块吸至准备好的饲养单层上或条件培养基中进行培养（见后）。

（2）免疫外科法(immunosurgery)（丛笑倩等1987，Solter et al. 1975）
1）将囊胚腔充分扩展、内细胞团明显的胚胎移至0.5%链霉蛋白酶液滴内，作用约5min，弃除透明带；
或在显微注射仪上用显微注射针剔除透明带；或进行培养，让胚胎自然孵化脱去透明带。

2）用链霉蛋白酶弃除透明带后，PBS洗涤无透明带胚胎三次。

1）用兔抗鼠脾脏细胞抗体处理无透明带胚胎20～30min。

2）用PBS 洗涤胚胎三次。

3）用新鲜豚鼠血清（补体）处理胚胎，溶解滋胚层细胞。

处理过程中，随时观察。

当滋胚层细胞膨大，呈透明空泡状即终止处理。

4）用PBS洗涤胚胎三次。

5）将胚胎移回培养液滴内，培养24hr。

6）重新用兔抗鼠抗体和豚鼠血清处理胚胎，弃除残余的滋胚层细胞。

7）将弃除滋胚层细胞的内细胞团移至培养液滴内继续培养。

48hr 后，见内细胞团生长，3～5d后细胞团进一步增大。

8）余下的操作同普通分离方法的4）～９）步骤。

4、胚胎干细胞有饲养层培养
（1）培养瓶（皿）明胶处理：同前。

（2）胚胎干细胞培养
1）用丝裂霉素-C或γ－射线处理后的饲养细胞种植到预先用明胶处理的φ1cm的培养孔内，做成饲养单层。

2）将分散的胚胎内细胞团小块吸置饲养层上。

一个内细胞团的细胞放置一个孔。

37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。

3）每天观察。

2天后，见胚胎干细胞小集落出现；3～4天集落进一步增大；6～10天，可进行消化传代。

4）消化时，弃培养液，用PBS洗涤1次，加入消化液。

用量以能覆盖细胞为度。

作用30sec 后，弃消化液，让残余的消化液继续作用。

轻敲培养板底部。

饲养细胞单层出现裂隙时，加入培养液终止消化。

或在倒置显微镜下观察，见细胞与细胞之间分开即加入培养液终止消化。

5）添加适量的培养液，轻轻吹打，使其成单细胞悬液。

接种到新的饲养层上扩大培养。

5. 胚胎干细胞无饲养层培养
1）用0.1%明胶水溶液处理φ1cm的培养孔。

方法同前。

2）在培养孔内加入条件培养基，每孔1ml。

3）将分散的内细胞团小块吸置于培养孔内。

一个内细胞团的细胞放置1个孔。

4）在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。

5）每天观察。

培养2d后，有胚胎干细胞样小集落出现，6～10d集落增大。

6）消化传代。

消化时，在倒置显微镜下观察，细胞之间分隔清楚时加入培养液终止消化，将细胞集落吹打至单细胞，加入条件培养液扩大培养。

6、已建系的胚胎干细胞体外培养
（1）有饲养层培养
1）用丝裂霉素-C或γ-射线处理已生长成片的饲养细胞，制备成饲养单层。

制备方法同前。

2）将已培养２～３d、生长旺盛的胚胎干细胞克隆消化成单细胞悬液。

消化方法同前。

3）添加胚胎干细胞培养液，以１：３～１：６比例转种到新的饲养单层上。

4）37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内继续培养。

（2）无饲养层培养
1）用明胶预先处理培养瓶。

方法同前。

2）将已培养２～３d、生长旺盛的胚胎干细胞克隆消化成单细胞悬液。

消化方法同前。

3）添加条件培养基，以１：３～１：６比例转种到新用明胶预先处理过的培养瓶内。

4）37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内继续培养。

7. 胚胎干细胞培养结果
胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界线不清楚。

消化成单细胞后可见细胞小而圆，核大，胞浆小。

细胞端粒酶水平高, 表面标记碱性磷酸酶呈阳性。

无饲养层培养时细胞集落的形态更加清楚典型（见照片）。

若饲养条件不适，胚胎干细胞会分化，细胞集落变得扁平，边缘不清楚，表面粗糙，见有较大内胚层样细胞结构，碱性磷酸酶检查呈阴性。

8．讨论
胚胎干细胞的分离与培养需要使用高糖的DMEM（4.5g/L）作为基础的培养基。

高糖的DMEM有助于囊胚的贴壁、内细胞团的增殖及胚胎干细胞集落的形成。

培养基是否含有丙酮酸钠皆可。

有研究表明（尚克刚等1992），对于胚胎干细胞的分离、克隆形成及细胞生长三方面，高糖无丙酮酸钠的培养基效果最佳，与低糖有丙酮酸钠和高糖有丙酮酸钠培养基有显著性差异。

培养液配制时，还要添加β–巯基乙醇(β-ME)或单硫甘油。

β–巯基乙醇(β-ME)。