表达GFP的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌体内感染抗原呈递细胞的动态变化

文章编号:1007-8738(2003)05-425-03
表达G FP 的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌体内感染抗原呈递细胞的动态变化
王　芳1,焦新安1,顾　健2,马　莉2,Richard Lo 2Man 3,Claude Leclerc 3,刘秀梵1
(1扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室;2苏北人民医院血液科,江苏扬州225009;3法国巴斯德研究所,法国巴黎75724)
收稿日期:2002-09-02;　修回日期:2002-10-30基金项目:教育部高校骨干教师资助计划项目(N o.
20001734)
中法先进研究计划合作项目(N o.PRAB 01204)
作者简介:王　芳(19722),女,新疆伊犁人,博士.
T el.(0514)7979343,Email :rwang fang @
通讯作者:焦新安.
In vivo dynamic changes of antigen pre 2
senting cells infected with recombinant attenuated Salmonella typhimurium ex 2pressing green fluorescent protein
WANG Fang 1
,
JIAO Xin 2an 1
,
G U Jian 2
,
MA Li 2
,
Richard Lo 2Man 3
,Claude Leclerc 3
,LIU Xiu 2f an
1
1
K ey Laboratory of Animal In fectious Disease of Ministry of Agricul 2
ture ,Y angzhou University ,2Department of Hematology of Subei People
’s H ospital ,Y angzhou 225009,China ;3Institut Pasteur Paris 75724,
France
Abstract
AIM :T o clarify in vivo dynamic change s of antigen 2pre senting cells (APCs )
early infected with recombinant attenuated
Salmonella typhimurium.METH ODS :BA LB/c mice were orally infected with recombinant attenuated Salmonella typhimurium expre ssing green fluore scent protein (GFP )X 4550(p Y AGFP ).Peritoneal macrophage s were taken out 3days after infection and cultured for 24hours ,then observed under the fluore scent micro scope.Moreover ,BA LB/c mice were also infected intra 2venously with X 4550(p Y AGFP )and low density cells (LDCs )were isolated and prepared from mouse spleen and liver 3,6and 12hours after infection.Infection rate s of macrophage s and dendritic cells (DCs )were analyzed by flow cytometry.RE 2SU LTS :About 50%peritoneal macrophage s were X 4550(p Y AGFP )po sitive.Infection rate s of macrophage s in spleen and liver were 20%～40%or so.As for the DCs ,the infection rate s in spleen and liver were about 4%～10%and 10%～20%,re spectively.CONC L USION :Recombinant attenuated Salmonella can be captured by APCs in vivo in early infection ,which provide s a precondition for inducing effective immune re 2sponse s.
K eyw ords :recombinant attenuated Salmonella typhimurium ;
green fluore scent protein ;antigen 2pre senting cell ;dynamic change s
摘要
目的:阐明重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内早期感染抗原呈递细胞(APC )的动态变化规律。

方法:用一定剂量的表达绿色荧光蛋白(G FP )的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X 4550(p Y AG FP )口服接种BA LB/c 小鼠。

3d 后,取腹腔巨噬细胞培养24h ,用荧光显微镜观察。

另以该细菌静脉注射小鼠,于感染后3、6和12h ,制备脾脏、肝脏低浮密度细胞。

用流式细胞术检测巨噬细胞和树突状细胞的感染率。

结果:巨噬细胞感染X 4550(p Y AG FP )的百分率,腹腔中约为50%,肝脏和脾脏中约为20%～40%。

树突状细胞感染X 4550(p Y AG FP )的百分率,脾脏中约为4%～10%,肝脏中约为10%～20%。

巨噬细胞的吞噬能力明显高于树突状细胞。

结论:感染早期,重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内已被APC 所摄取,为诱导有效的免疫应答提供了先决条件。

关键词:重组减毒鼠伤寒沙门氏菌;绿色荧光蛋白;抗原呈
递细胞;动态变化
中图分类号:R730.51 文献标识码:A
鼠伤寒沙门氏菌是一种具有侵袭力的肠道杆菌,可通过消化道小肠黏膜派伊尔结(Peyer ’s patch ,PP )上的M 细胞及树突状细胞(dendritic cell ,DC )进入机体,然后被巨噬细胞等吞噬细胞吞噬并在其内繁殖。

巨噬细胞和DC 是专职抗原呈递细胞(APC ),通过它们在体内的迁移,细菌可进入许多脏器组织,如小肠PP 结、肠系膜淋巴结、脾脏及肝脏等,同时能激发机体免疫系统产生针对细菌的各种免疫应答。

减毒鼠伤寒沙门氏菌虽然对动物和人体的毒力降低了许多,但仍具有侵袭力。

该菌不仅能在体外感染巨噬细胞和DC ,而且在体内也能感染巨噬细胞和DC 等细胞,并由这些APC 呈递抗原于T 细胞而产生细胞免疫应答。

鉴于目前关于减毒沙门氏菌在体内感染APC 的动态变化报道较少,我们报道了用表达绿色荧光蛋白(G FP )的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X 4550(p Y AG FP )口服和静脉注射BA LB/c 小鼠后,感染APC 的实验结果。

1　材料和方法
1.1　材料　表达G FP 的减毒鼠伤寒沙门氏菌X 4550(p Y AG FP )由本室构建[1]。

6～8wk 龄雌性BA LB/c (H 22d )小
鼠,购自中科院上海实验动物中心。

RP MI1640培养基购自
S igma 公司。

犊牛血清购自郑州佰安生物工程有限公司。

Ⅳ
型胶原酶、豚鼠补体、牛血清白蛋白(BS A )、抗Thy1.2(T 细胞)
单抗(mAb )及超亲和素标记的藻红蛋白(Phycoerythrin ,PE ),
购自S igma 公司。

生物素标记的抗Mac Ⅰ(M Ф)和抗C D11c (DC )mAb ,由法国巴斯德研究所惠赠。

1.2　方法
1.2.1　体内腹腔巨噬细胞感染试验　①细菌培养:将X 4550(p Y AG FP )先于液体LB 中以200r/min 振摇培养过夜,加入灭
菌5m ol/L NaCl 溶液,使培养基中NaCl 的终浓度为
300mm ol/L [2]。

然后于37℃静置培养4～5h 后,用平板计数
法计数[3]。

②动物接种及结果观察:口服X 4550(p Y AG FP )菌前,对BA LB/c 小鼠禁食、禁水过夜,然后先口服100g/L NaH 2
C O 3100μL ,30min 后口服细菌(2.6×1010CFU/只)[4]。

于口服3d 后,采集腹腔巨噬细胞,用RP MI1640完全培养基培养24h
后,于荧光显微镜下观察,选取多个视野,对视野中所有细胞和含细菌的细胞计数,计算感染率(含细菌的细胞数/细胞总数),取平均值并拍照。

1.2.2　肝、脾低浮密度细胞(LDC )的制备　按焦新安等[5]报
道的方法进行。

1.2.3　巨噬细胞和DC 感染率的检测　采用流式细胞术。

以
一定体积的含100m L/L 小牛血清的RP MI1640培养基悬浮细胞沉积,使细胞密度约为1010/L ;冰浴保存备用。

用FACS 染色缓冲液稀释下列各种抗体或标记试剂,包括生物素化的
mAb ,抗Mac ⅠmAb (1∶125)、抗C D11c mAb (1∶
50)及PE 标记的亲和素(后者用于生物素化单抗的第二步染色)。

将肝、脾LDC 分别加于96孔板中,每孔1×106～2×106个细胞,以
1300r/min 离心10min 。

弃上清,以FACS 洗涤缓冲液洗涤1次,分别加入50μL 稀释的抗Mac Ⅰ和抗C D11c mAb ,冰浴
作用45min ,用FACS 洗涤缓冲液洗涤3次(1300r/min ,
10min )。

加入PE 标记的亲和素50μL ,混匀,冰浴作用45min ,同法洗涤3次。

以P BS 悬浮细胞,移至FACS 分析专
用小试管内,600μL/管,用FACS Calibur 分析、测试上述细胞样品,用CellQuest 软件处理数据,各细胞的感染率为含重组菌的染色阳性细胞对所有染色阳性细胞的百分比。

2　结果
2.1　体内腹腔巨噬细胞感染试验　口服X 4550(p Y AG FP )3d
后,经荧光显微镜观察,约50%以上腹腔巨噬细胞感染了该菌(图1)。

图1　口服重组菌后3d 腹腔巨噬细胞感染的荧光显微镜观察
Fig 1　The observation of peritoneal macrophages on day 3post 2in fec 2
tion under fluorescence microscopy (×400)
2.2　肝、脾巨噬细胞和DC 中感染重组菌的感染率　静注后
3、6和12h ,肝脏中M
Φ和DC 的感染率均呈升高趋势,其中M Φ的感染率分别为13.3%、24.6%和27.1%;DC 的感染率分别为6.9%、11.9%和16.1%。

脾脏中巨噬细胞的感染率分别为25.4%、17.9%和36.8%,DC 的感染率分别为7.2%、
4.7%和11.8%(图2、3)。

图2　重组菌对脾脏巨噬细胞和DC 的感染
Fig 2　In fection of macrophages and DCs in spleen by recombinant
bacteria
a :N on 2in fected LDCs ;
b :In fected but unstained LDCs ;
c :In fecte
d LDCs stained with PE;d ,
e ,
f :In fection of macrophages at 3,6and 12hours after in 2fection ;
g ,
h ,
i :In fection of DCs at 3,6and 12hours after in fection ,respec 2
tively.
图3　重组菌对肝脏巨噬细胞和DC 的感染
Fig 3　In fection of macrophages and DCs in liver by recombinant bac 2
teria
a :N on 2in fected LDCs ;
b :In fected but unstained LDCs ;
c :In fecte
d LDCs
stained with PE;d ,e ,f :In fection of macrophages at 3,6and 12hours after in 2fection ;g ,h ,i :In fection of DCs at 3,6and 12hours after in fection ,respec 2tively.
3　讨论
沙门氏菌进入机体后,首先,巨噬细胞等吞噬细胞可通过反应性氧中间体(ROI)和反应性氮中间体(RNI)相继作用[6]而杀灭或阻止其在细胞中生长,并可阻止由其引起的细胞死亡。

另外,巨噬细胞还可依赖天然抵抗相关的巨噬细胞蛋白1 (natural2resistant2ass ociated macrophage protein1,Nram p1)阻止沙门氏菌形成隔离于胞浆的液泡,从而有利于巨噬细胞裂解沙门氏菌。

在体外,巨噬细胞还可表达P物质受体[7]抵抗沙门氏菌的感染。

其次,已进入体内的沙门氏菌能激发机体产生局部黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫,阻止沙门氏菌的进一步感染;而不象在体外环境中,随时间的延长,沙门氏菌不仅可感染更多培养的细胞,而且可在细胞内分裂繁殖。

因此,研究沙门氏菌的体内感染更有意义。

口服减毒菌X4550(p Y AG FP)后3d,约有50%以上的腹腔巨噬细胞感染了细菌,说明减毒鼠伤寒沙门氏菌不仅可通过消化道途径进入机体,而且可被巨噬细胞等吞噬细胞通过淋巴、血液循环携带向全身各处扩散,刺激相关的淋巴器官产生免疫应答,这是口服疫苗载体具有有效性的第一步。

由静脉注射后3、6、12h体内感染实验的结果可看出,肝、脾中巨噬细胞的感染率均大于相应脏器中DC,说明巨噬细胞是主要吞噬细胞。

肝脏中巨噬细胞和DC的感染率随时间的推移而逐渐升高。

肝脏中DC的存在及其被减毒鼠伤寒沙门氏菌的感染率与脾脏相似,提示肝脏作为一个非淋巴器官也参与了对该菌的免疫应答。

对此,目前尚未见有相关的报道。

在鼠伤寒沙门氏菌感染的过程中,巨噬细胞和DC不仅能摄取沙门氏菌,而且可作为APC呈递沙门氏菌抗原,在此过程中,这两种细胞不仅可裂解细菌,而且可将细菌蛋白加工成多肽片断,并通过MHC分子呈递于APC表面[8]。

巨噬细胞表面MHC分子和协同刺激分子的表达不充分,因而不能有效地激发幼稚T细胞并使之从外周组织向次级淋巴器官迁移[9]。

相反,成熟的DC则能有效地刺激幼稚T细胞,在激发免疫应答过程中起着关键作用[10]。

不成熟的DC在外周组织中虽可摄取并加工抗原物质,但不足以激活T细胞;成熟的DC抗原摄取的能力降低,但其MHC分子和协同刺激分子的表达增加。

外周组织中的DC遇到微生物抗原物质(如LPS或核苷酸),以及前感染细胞因子(如T NF2α)或I L21β时,逐渐成熟并在次级淋巴组织中激活幼稚T细胞[11]。

在抗细菌的免疫应答中,巨噬细胞和DC的功能可能不同。

巨噬细胞的主要作用是控制细菌的繁殖,并产生一些如I L212和T NF2α等细胞因子,DC则是激发T细胞免疫应答的关键APC。

有研究表明,在小鼠模型中发现,口服沙门氏菌后在PP结的DC中含有细菌;静脉、腹腔注射沙门氏菌后,在脾脏的C D11C+MHC2Ⅱ+DC中也存在此菌[10]。

这些负载鼠伤寒沙门氏菌的DC,能激发特异性的T细胞应答。

因此,本研究关于减毒鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞和DC的实验,为阐明细菌载体激发T 细胞免疫应答的机制提供了新的资料。

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