NK细胞无血清培养套装使用说明书——脐血2L体系

NK 细胞无血清培养套装使用说明书——脐血2L 体系
【适用范围】
【试剂准备】
【使用步骤】
【产品组成】
【脐血PBMC 分离】用于脐带血体外诱导扩增NK 细胞。

如用采血袋采集，由于采血袋中含有抗凝剂，务必保证血样净含量50mL （不包括抗凝剂体积），否则在接种细胞时细胞的总数量达不到接种要求，最终收获不到理想细胞数。

2L 培养体系套装：适用于50mL 脐带血的样本量，使用2L 培养基。

分离单个核细胞前，应将脐血、PBS （生理盐水）和淋巴细胞分离液室温平衡至20℃。

将脐带血平均分装到50 mL 离心管中，于室温下700g 离心15 min （离心机升速8，降速4）， 取上层淡黄色血浆至新的50mL 离心管中（下层红色液体用于提取单个核细胞），于水浴锅中 56℃灭活30min ，然后900g 离心10min ，取上清，置于-20℃，15min ，再次900g 离心10min ， 取上清，置于4℃保存。

（900g 离心时离心机的升降速均调节至最高即可） 1. 第0天
T175培养瓶包被:先将15mL PBS 加入T175瓶中，再将一支YC00A 添加于T175瓶中，充分混 匀后，37℃孵育2h ，弃去上清，并用15mL PBS 清洗一次,弃清洗液后备用。

接种45mL 培养 基A ，细胞密度2-3E6/mL ，添加诱导因子一支YC00B ， 添加10%比例的自体血浆。

2. 第3天
补加100mL 培养基B ，添加5%的自体血浆，动作轻柔、不可将贴壁细胞晃起。

3. 第5天
补加150mL 培养基B ，添加1%的自体血浆，分成两个T175进行培养，分瓶时轻轻将底部细胞 团吹起，单个的贴壁细胞不用过度吹打。

4. 第7天
补加300mL 培养基B ，添加1%的自体血浆，轻轻地将细胞团晃起后把所有细胞转移至细胞培 养袋，原瓶中各添加50mL 新鲜培养基B 。

原瓶中的单个贴壁细胞不用过度吹打。

(1) 取上一步血浆提取中得到的下层红色液体用生理盐水1：2稀释，混匀，备用。

(2) 另取2支新的50mL 的离心管，根据稀释血液的体积，按照1:1的比例将稀释血液缓慢加到 淋巴细胞分离液上层。

（如20mL 稀释血液，需要20mL 分离液） 使血液和淋巴细胞分离 液形成一个明显的分层，注意不要将稀释血液混入到淋巴细胞分离液中。

室温700g 离心30min 。

（离心机调节升速6，降速4）
注意：
每次添加的培养基需提前取出放置培养箱中预温至37℃，禁止将整瓶培养基放置37℃反复预温。

注意：
因脐血PBMC 中易掺入红细胞，计数结果常出现大的误差，这会导致接种密度出现偏差。

正常提取PBMC 的情况下，50mL 纯血（除去抗凝剂）接种50mL 体系，密度约为2-3E6/mL 。

1. 试剂准备
1. 培养基使用前务必添加YC005，每支用1mL NK 细胞无血清培养基溶解后添加至1L NK 细胞无 血清培养基中，混匀备用，命名为培养基A 。

2. 将诱导因子YC00C 、YC00D 、YC00E 溶解后添加至1L 培养基A 中，命名为培养基B 。

2. 血浆提取（离心机型号Thermo ST-40R ）
3. 单个核细胞的分离
5. 第9天
补加剩余的培养基B 和培养基A 共600mL 至细胞培养袋中，添加1%的自体血浆。

将原瓶中 50mL 培养基入袋后在原瓶中补加培养基A 各50mL 。

6. 第11天
每个培养瓶中各补加50mL 培养基A ，剩余培养基A 约500mL 添加至细胞培养袋中。

(3) 轻轻吸取单个核细胞（白膜层）并转移至新的50mL 离心管内；加入等体积生理盐水，
室温700g 离心10min 。

弃上清，再次用40mL 生理盐水清洗细胞，200g 离心10min ，弃上清。

用预温至37℃的培养基重悬细胞，备用，同时取少量细胞悬液计数。

（离心机升速均调节至9，降速9）保存温度2-8℃
-20℃
保存期限12个月
12个月
产品规格1000mL/瓶x21支，500uL/支1支，500uL/支1支，500uL/支1支，500uL/支1支，500uL/支
1支，500uL/支
2支产品用途 NK 细胞体外培养
YC00A:起始培养时包被培养瓶使用
YC00B:起始培养时添加YC00C:培养基B 添加YC00D:培养基B 添加YC00E:培养基B 添加
YC005:添加至培养基使用，每支/1L 庆大霉素:添加至培养基使用，100uL/1L
产品名称NK 细胞无血清培养基
NK 细胞诱导因子试剂盒（脐血2L 体系）产品型号：
AN0103.2
7. 第15-17天监测密度回收细胞
如用采血袋采集脐血，建议使用100mL 容量的采血袋。

如果采血时用200mL 采血袋，建议取出14mL 抗凝剂。

根据脐血采集量，抗凝剂占比可能在10%-40%，抗凝剂占比低于20%时，使用脐血自体血浆进行培养；抗凝剂占比高于20%时，血浆中的抗凝剂会抑制细胞生长，此时建议使用商品化的人AB 血清替代脐血自体血浆。

分离脐血PBMC 应特别注意两点，一是分离PBMC 前脐血及各试剂应预温至20℃，室温离心；二是脐血采集后应在8h 内分离PBMC 。

脐血PBMC 中易混入大量红细胞，流式细胞仪和血球计数板计数常出现大的偏差，推荐使用血细胞分析仪进行计数。

推荐接种密度为2-3E6/mL ，务必保证该接种密度，若接种密度低于2E6/mL 很可能导致培养失败。

1. 样本要求
2. 分离PBMC
3. PBMC 计数
脐血样本的NK 扩增速度较慢，培养时间要比外周血样本长，一般在第11-12天补液至2L ，第15-17天才能收获细胞。

冻存的PBMC 复苏后使用自体血浆或人AB 血清培养。

由于冻存导致PBMC 受损，接种后可见大量细胞凋亡，建议接种密度3E6/mL 。

7. 培养时间
8. 冻存的PBMC
【说明书核准日期】 2021年04月08日【版本号】 1.1.2
4. 接种密度
脐血PBMC 接种后，第1-3天会形成悬浮的细胞小团，第3-5天绝大部分悬浮细胞团贴壁，不可将其晃起，第5-7天贴壁的细胞团变大、变多，此时细胞已经处于激活状态，后期可正常换瓶、入袋正常样本的培养前期必然有细胞成团、贴壁的过程。

5. 细胞形态
参考补液程序
时间d0d3d5d7d9d11
50150150*250*250*2100*2
00060013001800
T175培养袋补液体积
总体积血浆量血浆比例50100150400700600
5015030070014002000
10%5%1%1%1%0%
551.5360
【特别说明】【参考补液程序】
生产企业：友康生物科技（北京）股份有限公司地址：北京市海淀区丰贤中路7号A 座三层、B 座一层网址： 电话：************
ISO9001、ISO13485
质量体系认证企业 国家高新技术企业
6. 贴壁细胞
培养过程中常有单个细胞贴壁，该贴壁细胞70%以上为NK 细胞，且扩增能力较强，如果在培 养过程中有大量贴壁细胞出现，一定不要丢弃贴壁的细胞，应该继续培养。

如果将细胞转入 细胞培养袋时，瓶中还存有大量贴壁细胞，不要用力吹打，要在原瓶中添加50mL 新鲜培养基 继续培养，2-3天后可转移至培养袋一起培养。

收获细胞时，在培养瓶中添加15mL PBS ，室温静置10min ，贴壁细胞就会自行脱落，再进行 回收。