高中生物5.3血红蛋白的提取和分离课件新人教版选修1
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④洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用 试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集
特别提醒 (1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。 (2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱 过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动， 说明色谱柱制作成功。
大小、形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳 在凝胶中加入SDS，使 蛋白质解聚成单链，与
各种蛋白质形成蛋白 质—SDS复合物，使其 迁移速率完全取决于分
子的大小
例1 (2011年聊城高二检测)有关凝胶色谱法和电 泳法的说法正确的是( ) A．它们都是分离蛋白质的重要方法 B．它们的原理相同 C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不 需要 D．以上说法都正确 【尝试解答】 __A__
血红蛋白的提取和分离
蛋白质的提取和分离一般分四步：样品处理 →粗分离→纯化→纯度鉴定。 1．样品处理
水分
ห้องสมุดไป่ตู้
液体成分 血浆约55%
血 无浆 机蛋 盐白 固体物质葡磷萄脂糖等
血液
有形成分 约45%
白细胞 血小板
红细胞→血红蛋白两条α－肽链
约90%
两条β－肽链 四个亚铁血红素基团
(1)红细胞的洗涤 ①采集血样→②低速短时间离心→③吸取血浆→④
【尝试解答】 (1)④→①→②→③ (2)不要破坏凝胶面 使吸管管口沿管壁环绕移动 (3)完全进入凝胶层 红色的蛋白质 5 【解析】 加样品时应严格按要求进行操作，吸 管应贴着管壁，管口沿着管壁环绕移动，还应注 意不要破坏凝胶面。等样品完全进入到凝胶层时， 才加入缓冲液进行洗脱。
【探规寻律】 对分离效果的判断 (1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随 洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。 (2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则 说明分离效果不好，装填不成功。
思考感悟 1．洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐 水？ 【提示】 生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定 而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前， 红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质 血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。
(2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和__甲__苯____的作 用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
第1层最上层：甲苯层无色透明 第2层中上层：脂溶性物质沉淀层白色薄层固体 第3层中下层：血红蛋白的水溶液层红色透明液体 第4层最下层：杂质沉淀层暗红色
特别提醒 (1)将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀 层。 (2)将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 血红蛋白水溶液层。
(4)透析 取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋 放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的 磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。目的是除去 样品中相对分子质量较小的杂质。
b．加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到
色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。 c．加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内. ②洗脱：加入_磷__酸__缓__冲__液___，打开下端出口，进行
洗脱。 4．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
五、操作提示 1．红细胞的洗涤：洗涤次数、离__心__速__度__与离心时
(2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联 葡聚糖凝胶) ①固定：将色谱柱垂直固定在支架上
②装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内
③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h
(3)样品的加入和洗脱 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
②滴加透析样品：用量为1 mL
③样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层
课标领航
1．概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子 的基本原理。 2．能根据凝胶色谱过程中的现象和结果， 评价实验操作的过程是否规范，分析实验结 果。 3．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离， 体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本 过程和方法。 【重点】 凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】 实验操作的过程及分析。
例2 下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的 加入(图Ⅰ)和洗脱(图Ⅱ)示意图，请据图回答下列 问题。
(1) 在 加 样 示 意 图 中 ， 正 确 的 加 样 顺 序 是
_____________________________________________ ___________________________。 (2) 用 吸 管 加 样 时 ， 应 注 意 正 确 操 作 ， 分 别 是 ① ______________ 、 ② 贴 着 管 壁 加 样 、 ③ ______________。 (3)等样品__________时，才加入缓冲液，待 ______________________接近色谱柱底端时，用试 管收集流出液，每______________mL收集一管，连 续收集。
【互动探究】 (1)凝胶色谱柱的装填应注意哪些 事项？ (2)血红蛋白溶液是如何分离的？ 【提示】 (1)①装填前为了加速膨胀，可以加入 洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约 时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒 内的空气。 ②装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白 质的洗脱次序，降低分离效果。 ③装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现 象。
盐水洗涤→⑤低速离心→⑥重复④⑤步骤三次。 特别提醒
(1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续 步骤的进行。 (2)离心时转速要低，时间要短，一般为500 r/min， 离心2 min。 (3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤 次数。
(2)血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再 加 40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌 10 min。在 蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管中，以 2 000 r/min 的速度离 心 10 min 后，试管中的溶液分为 4 层：
【解析】 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大 小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待 测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的 大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速 度，从而实现样品中各种分子的分离。这两种方 法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度。 【误区警示】 不同的蛋白质在凝胶色谱中有三 种运动情况： (1)分子很小，可进入凝胶全部内孔隙； (2)分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙； (3)分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小 相应部分。
跟踪训练 下列各项中，一般不影响凝胶色谱法 分离蛋白质的分离度的是( ) A．层析柱的高度 B．层析柱的直径 C．缓冲溶液 D．样品的分布 解析：选B。分离度取决于柱高，为分离不同组
分，凝胶柱必须有适宜的高度，分离度与柱高的
平方根相关。样品的分布也影响分离度，缓冲溶 液的pH影响蛋白质所带的电荷，因此也影响分 离度。只有层析柱的直径一般不会影响分离度。
电极移动。
3．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电 性质的差异及分子本身的大小、形__状__的不同，使带 电分子产生不同的__迁__移__速__度____，从而实现样品中 各种分子的分离。 4．方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚 丙烯酰胺凝胶电泳。
四、实验操作 1．样品处理：通过_红__细__胞__的__洗__涤____、 _血__红__蛋__白__的__释__放_______、分离血红蛋白溶液等操作 收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取 低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红 细胞已洗涤干净。
间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白： 离心速度过高和时间过长会使_白__细__胞__等一同沉淀， 达不到分离效果。
2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接 放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用 __沸__水__浴__加热，加速膨胀。 3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得 有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果。 4．蛋白质的分离：如果红色区带__均__匀__一__致__地 移动，说明色谱柱制作成功。
2．凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作 ①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂 纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部 →覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。
特别提醒 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮 塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还 会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
核心要点突破
解读实验原理
1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
直径大小
运动方式 运动速度 运动路程
洗脱次序
相对分子质量大
相对分子质量小
大于凝胶颗粒空隙直 小于凝胶颗粒空隙直
径
径
垂直向下运动
无规则的扩散运动
较快
较慢
较短
较长
先从凝胶柱中洗脱出 来
后从凝柱中洗脱出来
2.电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
由于琼脂糖本身不带电 荷，各种分子在电场中 迁移速率决定于所带电 荷性质的差异及分子的
思考感悟 2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的 目的是什么？ 【提示】 (1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。 (2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机 溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红 蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后, 将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,
于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透
明液体。 2．粗分离：即透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋 放入一定量适宜浓度的_磷__酸__缓__冲__液__中，透析12 h. (2)目的：将样品中分子较小的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分 子物质保留在袋内。
基础自主梳理
一、凝胶色谱法 1．概念：也称作分配色谱法，是根据_相__对__分__子___ 质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2．原理 (1)由微小的多孔球体构成的凝胶，内部有许多贯 穿的通道。
(2)由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对 分子质量_较__小__的蛋白质容易进入凝胶内部的通道， 路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的 蛋 白 质 无 法 进 入 凝 胶 内 部 的 通 道 ， 只 能凝在胶__外__部____ 移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子 质量不同的蛋白质分子得以分离。 二、缓冲溶液 1．作用：在一定范围内，抵制外界的__酸__和__碱__对溶 液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)蛋白质的分离是根据离心原理进行的。当含有细 小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使 得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反 之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下 移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且 又与重力场的强度及液体的黏度有关。像红细胞大 小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用 下观察到它们的沉降过程。
2．配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成， 通过调节缓冲剂的_使__用__比__例_就可以得到不同pH范
围内使用的缓冲液。
三、电泳 1．概念：指_带__电__粒__子_在电场的作用下发生迁移的
过程。 2．原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分
子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作 用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_相__反__的
3．纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的
杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填
①材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。 ②方法：凝胶用_蒸__馏__水__充分溶胀后，配成凝胶悬 浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有__气__泡__存
在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 ①a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上 的缓冲液缓慢下降到与__凝__胶__面__平齐，关闭出口。
情境导引
为年老多病的人注射丙种 球蛋白，可以在一定程度上增强 其身体的抵抗力。在动物体内， 丙种球蛋白和许多蛋白质混合 在一起。要获得纯净的丙种球蛋 白制品，就必须进行提取和分离。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差 异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种 分子的分离。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用 试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集
特别提醒 (1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。 (2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱 过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动， 说明色谱柱制作成功。
大小、形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳 在凝胶中加入SDS，使 蛋白质解聚成单链，与
各种蛋白质形成蛋白 质—SDS复合物，使其 迁移速率完全取决于分
子的大小
例1 (2011年聊城高二检测)有关凝胶色谱法和电 泳法的说法正确的是( ) A．它们都是分离蛋白质的重要方法 B．它们的原理相同 C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不 需要 D．以上说法都正确 【尝试解答】 __A__
血红蛋白的提取和分离
蛋白质的提取和分离一般分四步：样品处理 →粗分离→纯化→纯度鉴定。 1．样品处理
水分
ห้องสมุดไป่ตู้
液体成分 血浆约55%
血 无浆 机蛋 盐白 固体物质葡磷萄脂糖等
血液
有形成分 约45%
白细胞 血小板
红细胞→血红蛋白两条α－肽链
约90%
两条β－肽链 四个亚铁血红素基团
(1)红细胞的洗涤 ①采集血样→②低速短时间离心→③吸取血浆→④
【尝试解答】 (1)④→①→②→③ (2)不要破坏凝胶面 使吸管管口沿管壁环绕移动 (3)完全进入凝胶层 红色的蛋白质 5 【解析】 加样品时应严格按要求进行操作，吸 管应贴着管壁，管口沿着管壁环绕移动，还应注 意不要破坏凝胶面。等样品完全进入到凝胶层时， 才加入缓冲液进行洗脱。
【探规寻律】 对分离效果的判断 (1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随 洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。 (2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则 说明分离效果不好，装填不成功。
思考感悟 1．洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐 水？ 【提示】 生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定 而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前， 红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质 血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。
(2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和__甲__苯____的作 用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
第1层最上层：甲苯层无色透明 第2层中上层：脂溶性物质沉淀层白色薄层固体 第3层中下层：血红蛋白的水溶液层红色透明液体 第4层最下层：杂质沉淀层暗红色
特别提醒 (1)将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀 层。 (2)将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 血红蛋白水溶液层。
(4)透析 取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋 放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的 磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。目的是除去 样品中相对分子质量较小的杂质。
b．加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到
色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。 c．加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内. ②洗脱：加入_磷__酸__缓__冲__液___，打开下端出口，进行
洗脱。 4．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
五、操作提示 1．红细胞的洗涤：洗涤次数、离__心__速__度__与离心时
(2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联 葡聚糖凝胶) ①固定：将色谱柱垂直固定在支架上
②装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内
③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h
(3)样品的加入和洗脱 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
②滴加透析样品：用量为1 mL
③样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层
课标领航
1．概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子 的基本原理。 2．能根据凝胶色谱过程中的现象和结果， 评价实验操作的过程是否规范，分析实验结 果。 3．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离， 体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本 过程和方法。 【重点】 凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】 实验操作的过程及分析。
例2 下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的 加入(图Ⅰ)和洗脱(图Ⅱ)示意图，请据图回答下列 问题。
(1) 在 加 样 示 意 图 中 ， 正 确 的 加 样 顺 序 是
_____________________________________________ ___________________________。 (2) 用 吸 管 加 样 时 ， 应 注 意 正 确 操 作 ， 分 别 是 ① ______________ 、 ② 贴 着 管 壁 加 样 、 ③ ______________。 (3)等样品__________时，才加入缓冲液，待 ______________________接近色谱柱底端时，用试 管收集流出液，每______________mL收集一管，连 续收集。
【互动探究】 (1)凝胶色谱柱的装填应注意哪些 事项？ (2)血红蛋白溶液是如何分离的？ 【提示】 (1)①装填前为了加速膨胀，可以加入 洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约 时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒 内的空气。 ②装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白 质的洗脱次序，降低分离效果。 ③装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现 象。
盐水洗涤→⑤低速离心→⑥重复④⑤步骤三次。 特别提醒
(1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续 步骤的进行。 (2)离心时转速要低，时间要短，一般为500 r/min， 离心2 min。 (3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤 次数。
(2)血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再 加 40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌 10 min。在 蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管中，以 2 000 r/min 的速度离 心 10 min 后，试管中的溶液分为 4 层：
【解析】 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大 小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待 测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的 大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速 度，从而实现样品中各种分子的分离。这两种方 法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度。 【误区警示】 不同的蛋白质在凝胶色谱中有三 种运动情况： (1)分子很小，可进入凝胶全部内孔隙； (2)分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙； (3)分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小 相应部分。
跟踪训练 下列各项中，一般不影响凝胶色谱法 分离蛋白质的分离度的是( ) A．层析柱的高度 B．层析柱的直径 C．缓冲溶液 D．样品的分布 解析：选B。分离度取决于柱高，为分离不同组
分，凝胶柱必须有适宜的高度，分离度与柱高的
平方根相关。样品的分布也影响分离度，缓冲溶 液的pH影响蛋白质所带的电荷，因此也影响分 离度。只有层析柱的直径一般不会影响分离度。
电极移动。
3．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电 性质的差异及分子本身的大小、形__状__的不同，使带 电分子产生不同的__迁__移__速__度____，从而实现样品中 各种分子的分离。 4．方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚 丙烯酰胺凝胶电泳。
四、实验操作 1．样品处理：通过_红__细__胞__的__洗__涤____、 _血__红__蛋__白__的__释__放_______、分离血红蛋白溶液等操作 收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。分离时采取 低速短时间离心，直至上清液中没有黄色，表明红 细胞已洗涤干净。
间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白： 离心速度过高和时间过长会使_白__细__胞__等一同沉淀， 达不到分离效果。
2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接 放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用 __沸__水__浴__加热，加速膨胀。 3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得 有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果。 4．蛋白质的分离：如果红色区带__均__匀__一__致__地 移动，说明色谱柱制作成功。
2．凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作 ①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂 纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部 →覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。
特别提醒 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮 塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还 会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
核心要点突破
解读实验原理
1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
直径大小
运动方式 运动速度 运动路程
洗脱次序
相对分子质量大
相对分子质量小
大于凝胶颗粒空隙直 小于凝胶颗粒空隙直
径
径
垂直向下运动
无规则的扩散运动
较快
较慢
较短
较长
先从凝胶柱中洗脱出 来
后从凝柱中洗脱出来
2.电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
由于琼脂糖本身不带电 荷，各种分子在电场中 迁移速率决定于所带电 荷性质的差异及分子的
思考感悟 2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的 目的是什么？ 【提示】 (1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。 (2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机 溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红 蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：把搅拌好的混合液离心后, 将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层,
于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透
明液体。 2．粗分离：即透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋 放入一定量适宜浓度的_磷__酸__缓__冲__液__中，透析12 h. (2)目的：将样品中分子较小的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分 子物质保留在袋内。
基础自主梳理
一、凝胶色谱法 1．概念：也称作分配色谱法，是根据_相__对__分__子___ 质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2．原理 (1)由微小的多孔球体构成的凝胶，内部有许多贯 穿的通道。
(2)由相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对 分子质量_较__小__的蛋白质容易进入凝胶内部的通道， 路程较长，移动速度较慢，而相对分子质量较大的 蛋 白 质 无 法 进 入 凝 胶 内 部 的 通 道 ， 只 能凝在胶__外__部____ 移动，路程较短，移动速度较快，从而使相对分子 质量不同的蛋白质分子得以分离。 二、缓冲溶液 1．作用：在一定范围内，抵制外界的__酸__和__碱__对溶 液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)蛋白质的分离是根据离心原理进行的。当含有细 小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使 得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反 之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下 移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且 又与重力场的强度及液体的黏度有关。像红细胞大 小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用 下观察到它们的沉降过程。
2．配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成， 通过调节缓冲剂的_使__用__比__例_就可以得到不同pH范
围内使用的缓冲液。
三、电泳 1．概念：指_带__电__粒__子_在电场的作用下发生迁移的
过程。 2．原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分
子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作 用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_相__反__的
3．纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的
杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填
①材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。 ②方法：凝胶用_蒸__馏__水__充分溶胀后，配成凝胶悬 浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有__气__泡__存
在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 ①a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上 的缓冲液缓慢下降到与__凝__胶__面__平齐，关闭出口。
情境导引
为年老多病的人注射丙种 球蛋白，可以在一定程度上增强 其身体的抵抗力。在动物体内， 丙种球蛋白和许多蛋白质混合 在一起。要获得纯净的丙种球蛋 白制品，就必须进行提取和分离。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差 异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种 分子的分离。