基因工程技术在废水处理中的应用研究

基因工程技术在废水处理中的应用研究
基因工程技术在废水处理中的应用研究
摘要：随着科技的发展,产生了一系列严重的环境污染问题，尤其是对水的污染。

越来越多的废水难以用传统方法进行处理，而基因工程技术作为一项新技术，逐渐应用到废水处理中。

基因工程技术是在DNA分子水平上按照人们的意愿进行的定向改造生物的新技术。

本文介绍了基因工程技术的发展历程、基本原理，对该技术的特点及研究内容进行了说明，重点介绍了基因工程技术在废水处理中的应用，并对其发展趋势作了展望。

关键词：基因工程；原理；特点；废水处理；应用
1引言
众所周知，环境污染现已远远超出了自然界微生物的净化能力，尤其是在废水处理方面。

如今生物法是废水处理的主要方法，但生物法也有其局限性，并且有些特殊污水用自然界中自然进化的微生物难于降解，而基因工程的引进开辟了培育高降解能力新品菌种的方法，利用基因工程技术检测微生物性状、提高微生物净化环境的能力是用于废水治理的一项关键技术[1]。

20世纪50年代初, 由于分子生物学和生物化学的发展, 对生物细胞核中存在的脱氧核糖核酸(DNA)的结构和功能有了比较清晰的阐述。

20世纪70年代，Berg 等首次用限制性内切酶EcoRI切割病毒SV40 DNA和λ噬菌体DNA，经过连接，组成重组DNA分子，宣告了基因工程的诞生[2]。

这一技术发展到今天, 正形成产业化并列为世界领先专业技术领域之一, 广泛应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源和国防等许多部门,并日益显示出其巨大的潜力, 将为世界面临的环境保护等问题的解决提供广阔的应用前景。

2基因工程技术概述
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术或DNA重组技术，是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法,按照人类的需要, 用DNA重组技术对生物基因组的
结构或组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或对人类有益的生物性状[3]。

基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

2.1基因工程技术的原理
基因工程技术是一种按照人们的构思和设计,在体外将一种生物的个别基因插入质粒或其他载体分子, 构成遗传物质的重组, 然后导入到原先没有这类分子的受体细胞内进行无性繁殖, 使重组基因在受体细胞内表达, 产生出人类所需要的基因产品的操作技术。

或者说, 基因工程技术是在生物体外, 通过对一种
生物的DNA分子进行人工剪切和拼接, 对生物的基因进行改造和重新组合, 再把它导入另一种生物的细胞里, 定向地改造生物的遗传性状, 产生出具有新的遗传特性的生物[4]。

2.2基因工程技术的特征
(1) 跨物种性
外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。

(2) 无性扩增
外源DNA在宿主细胞内可大量扩增和高水平表达。

2.3基因工程技术的研究内容
一个完整的基因工程技术流程一般包括目的基因的获得、载体的制备、基因的转移、基因的表达、基因工程产品的分离提纯等过程。

详细步骤和内容如下：(1) 从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR扩增等步骤, 分离出带
有目的基因的DNA片段；
(2) 在体外, 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择
记号的载体分子上,形成重组DNA分子；
(3) 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞) , 并与之一起增殖；
(4) 从大量的细胞增殖群体中, 筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆；
(5) 从这些筛选出来的受体细胞克隆, 提取出已经得到扩增的目的基因, 供进
一步分析研究使用；
(6) 将目的基因克隆到表达载体上, 导入受体细胞, 使之在新的遗传背景下实
现功能表达, 产生出人类所需要的物质[5]。

3基因工程技术在废水处理中的应用
随着环境污染的加剧，出现了很多用传统方法难以解决的问题，于是基因工程技术逐渐被应用到环境保护中，尤其在废水的处理方面。

3.1基因工程技术在污水检测中的应用
3.1.1聚合酶链反应(PCR)技术在污水检测中的应用
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。

由于反应循环可进行一定次数(通常为25~30个循环)，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。

这种技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。

PCR技术的基础是只有在微生物特定核酸存在的条件下，重复性酶促DNA 合成和扩增才能够发生。

PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳来检验和纯化，也可以被用来克隆、转化和测序.在具体应用中往往采用经过修正的或与其它技术联合应用的PCR衍生技术，如RT-PCR、竞争PCR、PCR-DGGE、PCR-SSCP 和巢式PCR等[6]。

PCR通过对待测DNA片段的特异性扩增，一方面作为菌株定性鉴定的重要手段，同时也为定性和定量研究微生物的群落特征提供帮助。

自PCR技术问世以来，通过其自身的不断完善以及同其它相关技术的联用，在污水生物处理微生物的检测和鉴定方面得到了长足的发展，为该领域的研究提供了一个高效、灵敏、简便的研究工具。

应用PCR-DGGE ( Polymerase Chain Reaction Denaturing Gradient Gel Electrphoreses)方法对环境微生物进行研究可以不经过培养，直接从样品中提取细菌的DNA，再将编码有16SrDNA的基因进行扩增。

通
过这种方法能够直接了解样品中微生物分布结构，并能大致比较相同条件下单一菌群的生物量。

王峰等[7]采用PCR-DGGE技术来分析活性污泥与生物膜中微生物种群的结构，可以不经过常规培养而直接从活性污泥和生物膜样品中提取DNA；Marsh 等[8]利用PCR-DGGE分析并获得了活性污泥中真核微生物的种群变化情况。

以上的事实均说明，PCR-DGGE结合测序技术是一种完全可行的适于环境样品微生物研究的快速分析方法。

3.1.2荧光原位杂交技术(FISH)技术在污水检测中的应用
荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，能够在自然的微生物环境中检测和鉴定不同的微生物个体，并提供污水处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息。

FISH技术的基本原理是通过荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号从而对未知的核酸序列进行检测[9]。

近年来，对污水处理的研究已经从简单研究污水处理的表征现象转移到更深入地研究活性污泥内部微生物种类及其特性。

荧光原位杂交技术是一种微生物生态的研究技术，在测定过程中不破坏细胞、保持细胞形态完整，能够真实反映在自然环境下微生物的形态结构及分布状态。

FISH技术的优势在于可以了解微生物在污泥中的数量、形态及分布状态等。

虽然FISH技术在应用过程中还存在着一些问题，如：检测的假阳性、假阴性等。

但是，目前FISH技术在不断发展完善的同时，已与其他分子生物技术相结合，这样更能反映出污水中微生物种群的多样性以及定量分析微生物种群在空间的动态变化[10]。

3.1.3DNA重组技术在污水检测中的应用
DNA重组技术的实质是，将两个或多个单独的DNA片段连接起来产生一个能在特定宿主中自主复制的DNA分子。

其基本程序是:外源DNA的获得；选择载体并进行处理；将目的DNA片段和处理后的载体连接；将连接产物导入合适
的宿主细胞内，使重组DNA分子在宿主细胞内复制扩增；将转化菌落在平板培养基上培养成单个菌落，筛选获得含有重组DNA的阳性
克隆[11]。

在废水的处理过程中仅靠分离和筛选的功能性微生物是不够的。

在混合的微生物群体中筛选特定的微生物菌种时往往得不到预期的结果；特定的微生物可能难以培养，从而无法应用到实际的生物反应器中；人类排放到环境中的污染物越来越复杂且难以处理。

因此，有必要通过基因工程技术并根据具体的需要构建有效的基因工程菌或培育出可高效降解复杂多样的有害污染物的细菌来解决以上的问题。

3.2基因工程技术在有机废水处理中的应用
生物处理法是废水中有机污染物降解的主要方法，但是部分难降解有机污染物需要不同降解菌之间的协同代谢或共代谢等复杂机制才能最终得以降解,这无疑降低了污染物的降解效率。

首先,污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程,对细菌来说这是一种不经济的营养方式；其次,某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性，对代谢活性有抑制作用；此外,将不同种属、来源的细菌的降解基因进行重组,把分属于不同菌体中的污染物代谢途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌,可以有效地提高微生物的降解能力。

刘春等[12]以生活污水为共基质,考察了基因工程菌在MBR和活性污泥反应器中对阿特拉津的生物强化处理效果,以及生物强化处理对污泥性状的影响。

结果表明,基因工程菌在MBR中对阿特拉津具有很好的生物强化处理效果,阿特拉津平均出水浓度为0.84 mg/L,平均去除率为95%,最大去除负荷可以达到70mg/(L·d)。

生物强化的MBR对生活污水中COD的平均去除率为71%,COD平均出水浓度65mg/L。

吕萍萍等[13]研究发现，克隆有苯降解过程中的关键基因——甲苯加双氧酶的基因工程菌E.coli.JM109(pKST11)对苯具有较高的降解效率和降解速度,应用于固定化细胞反应器中效果突出。

在较短的水力停留时间内,可以将1500mg/L苯降解70%,降解速度为1.11mg/(L·s),延长水力停留时间,可以使去除率达到95%以上。

该反应器对高浓度的苯具有突出的处理效果。

同时所得到的产物为环己二烯双醇,可以被野生非高效菌W3快速利用。

3.3基因工程技术在重金属废水处理中的应用
处理重金属废水的传统方法有:中和沉淀法、化学沉淀法、氧化还
原法、气浮法、电解法、蒸发和凝固法、离子交换法、吸附法、溶剂萃取法、液膜法、反渗透和电渗析法等。

目前最常用的就是基因工程技术，它与传统的处理方法相比,具有以下优点[14]:
(1)在低浓度下,金属可以被选择性地去除；
(2)节能,处理效率高；
(3)操作时的pH值和温度条件范围宽；
(4)易于分离回收重金属；
(5)吸附剂易再生利用；
(6)对钙、镁离子吸附量少；
(7)投资小,运行费用低,无二次污染。

3.3.1基因工程菌强化生物化学法处理重金属废水
生物化学法指通过微生物处理含重金属废水,将可溶性离子转化为不溶性化合物而去除。

硫酸盐生物还原法是一种典型生物化学法,该法是在厌氧条件下硫酸盐还原菌通过异化的硫酸盐还原作用,将硫酸盐还原成H2S,重金属离子和H2S 反应生成溶解度很低的金属硫化物沉淀而被去除,同时H2SO4的还原作用可将SO42-转化为S2-而使废水的pH 值升高,从而形成重金属的氢氧化物而沉淀。

中国科学院成都生物研究所从电镀污泥、废水及下水道铁管内分离筛选出35株菌株,从中获得高效净化Cr(VI)复合功能菌。

袁建军等[15]利用构建的高选择型基因工程菌生物富集模拟电解废水中的汞离子,发现电解废水中其他组分的存在可以增大重组菌富集汞离子的作用速率,且该基因工程菌能在很宽的pH范围内有效地富集汞。

但高浓度的重金属废水对微生物毒性大,故此法有一定的局限性,不过,可以通过遗传工程、驯化或构造出具有特殊功能的菌株,微生物处理重金属废水一定具有十分良好的应用前景。

3.3.2基因工程强化生物絮凝法处理重金属废水
生物絮凝法是利用微生物或微生物产生的具有絮凝能力的代谢物进行絮凝沉淀的一种除污方法。

生物絮凝剂又称第三代絮凝剂，是带电荷的生物大分子，主要有蛋白质、黏多糖、纤维素和核糖等。

目前普遍接受的絮凝机理是离子键、氢键结合学说。

前述硅酸盐细菌处理
重金属废水可能的机理之一就是生物絮凝作用。

目前对于硅酸盐细菌絮凝法的应用研究已有很多，有些已取得显著成果。

运用基因工程技术，在菌体中表达金属结合蛋白分离后，再固定到某些惰性载体表面，可获得高富集容量絮凝剂[16]。

3.4基因工程菌在制药废水处理中的应用
化学合成制药废水中有机污染物浓度高、可生化性差且组分复杂, 属于难处理废水。

利用基因工程技术构建高选择性基因工程菌可以提高微生物生物强化处理技术。

因此，采用跨界融合技术，构建基因工程菌Xhhh处理制药废水，其出水水质可以达到《污水综合排放标准》GB 8978—1996 一级标准。

运行结果表明，该工艺处理效果稳定高效[17]。

4结语
自2000年，国际上提出基于系统生物学原理的基因工程概念后，基因工程被应用于社会各个领域，并且手段日新月异。

在环境领域当中，基因工程正迅速应用到废水检测和废水治理当中，培养出新的特效物种并进一步提高其应用效率、降低应用成本。

随着分子生物学技术、环境工程检测技术的发展，并结合我们已经掌握的微生物群落结构和功能方面的知识,我们逐渐了解到污水生物处理系统中微生物群体的多样性、实际生存状态、功能特点,并更有效地对其加以开发和利用。

此外，基因工程菌的出现，使以往的一些难降解有机废水、制药废水、石油废水、重金属污染废水以及其他有毒有害废水等都得到了有效地治理，还会实现废水资源化。

当前，引入DNA扩增和其它生物技术的环境监测方法等将是基因工程技术研究的侧重方向。

基因工程技术作为一种新兴技术以极快的速度发展着。

以下两方面的研究将对水资源的保护有重要意义。

一是对基因工程菌的深入研究，如基因工程菌对污染物的代谢途径、控制目的基因表达的启动子基因序列、降解基因表达的调控条件的优化等方面的研究。

二是对环境中微生物的习性及基因工程菌与环境中微生物和污染物之间的相互作用进行研究。

从而使基因工程菌在治理有机物污染方面的实际应用成为可能。

目前的研究主要是利用单一的基因工程菌对污染物进行处
理,随着研究的不断深入,利用多种基因工程菌相结合对污染物进行处理,将对水资源保护起到更为重要的作用。

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