cDNA和基因组文库DNA的构建

结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
pGEM3z EMBL,λgt系列
M13系列
PCYPAC
SV40 载体,昆虫杆 状病毒载体
pSVK3质粒,：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
• 4.5.用酚：氯仿抽提,再通过Sephadex G-50离心柱层析,除去未掺入 的dNTP. 4.6.在柱流出液中加入0.1倍体积的3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）和二 倍体积的乙醇,样品于4℃至少放置15 min. 4.7.在微量离心机上以最大速度离心15 min(4℃),回收沉淀的cDNA. 沉淀经空气干燥后溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).
• 5 . 3.在吸管宽端接一段乙烯泡沫管,让糊状物静置数分 钟,放开止血钳,当缓冲液从吸管滴落时,层析柱亦随之形 成.如有必要,可加入更多的Sepharose CL-4B,直至填充 基质几乎充满吸管为止. 5 . 4.将几倍柱床体积的含0.1 mol/L氯化钠的TE(pH7.6) 洗涤柱子.洗柱完成后,关闭柱子底部的软管. 依据大小分离回收DNA
2：cDNA第二链的合成
• 2 . 1：cDNA第二链的合成将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中、
• 10mMol/L mgcl2 70ul • 2mM/L Tris-Hcl(PH7.4) 5ul
10 mCi/mlα-32P dCTP（400 Ci/mmol） 10μl 1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl RNase H (1000单位/ml) 1μl 大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl 温和振荡将上述试剂混合,在微量离心机稍离心,以除去所有气泡.在16℃温育2~4h. 2 . 2.温育结束,将下列试剂加到反应混合物中： β-NAD (50 mmol/L) 1μl 大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml) 1μl 室温温育15min.
• 2 . 11. 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇, 沉淀柱层析洗脱下来的cDNA,将样品置于冰上至少15分钟,然后在 微量离心机上以最大速度4℃离心15分钟,回收沉淀DNA.用手提微 型监测仪检查,是否所有放射性都沉淀下来. 2 . 12. 用70%乙醇洗涤沉淀物,重复离心. 2 . 13. 小心吸出所有液体,空气干燥沉淀物. 2 . 14. 如果需要用EcoR I甲基化酶对cDNA进行甲基化,可将cDNA 溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中.另外,如果要将cDNA直接与Not I或 Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连,可将cDNA悬浮在29μl TE(pH7.6) 溶液.沉淀的DNA重新溶解后,尽快进行达的 基因序列信息,用于研究特定细胞中基体的种类和特征：
质粒
λ噬菌体 丝状噬菌体 及噬菌粒 粘粒载体
BAC PAC YAC
MAC 病毒载体
穿梭载体
受体细胞 E.coli
E.coli E.coli
• 2 . 3.温育结束,加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶. 反应混合物室温温育15分钟. 2 . 4.取出3μl反应物,按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量. 2 . 5.将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中,用酚：氯仿和氯 仿分别抽提混合物一次.在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下,通过乙醇沉淀回 收DNA,将DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中. 2 . 6.将下列试剂加到DNA溶液中： 10×T4多核苷酸激酶缓冲液 10μl T4多核苷酸激酶（3000单位/ml） 1μl 室温温育15分钟. 2 . 7.测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度,测定1μl第二链合成 产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度.
•
3 . 9.按下述方法分析4个小样对照反应： a. 在每一对照反应中分别加入： 0.1 mol/L MgCl2 2μl 10×EcoR I 缓冲液 2μl 加H2O至 20μl b. 在2号和4号反应管中分别加入20单位EcoR I. c. 四个对照样品于37℃温育1h,通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析. 3 . 10. 微量离心机以最大速度离心15min(4℃)以回收沉淀cDNA.弃上清,加 入200μl 70%乙醇洗涤沉淀,重复离心. 3 . 11. 用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀.小心吸出 乙醇,在空气中晾干沉淀,然后将DNA溶于29μl TE（pH8.0）. 3 . 12. 尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段.
• 5 . 9.电泳后将凝胶移至一张Whatman 3MM滤纸上,盖上一张Saran 包装膜,并在凝胶干燥器上干燥.干燥过程前20min至30min于50℃ 加热凝胶,然后停止加热,在真空状态继续干燥1~2h. 5 . 10. 置-70℃加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光. 5 . 11. 在cDNA长度≥500bp的收集管中,加入0.1倍体积的3mol/L乙 酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇.于4℃放置至少15min使cDNA沉 淀,用微量离心机于4℃以12 000g离心15min,以回收沉淀的cDNA.
6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
• 6 . 1.按下述方法建立4组连接-包装反应： • 连接A(μl)B(μl)C(μl)D(μl)λ噬菌体DNA(0.5μg/μl)1.01.01.01.010×T4DNA连
接酶缓冲液1.01.01.01.0cDNA0 ng5 ng10 ng50 ngT4噬菌体DNA连接酶 （105 Weiss单位/ml）0.10.10.10.110 mmol/L ATP1.01.01.01.0加H2O至 10101010连接混合物于16℃培育4~16h.剩余的cDNA储存于-20℃. 6 . 2.按包装提取物厂商提供的方法,从每组连接反应物中取5μl包装到噬菌 体颗粒中. 6 . 3.包装反应完成后,在各反应混合物中加入0.5ml SM培养基.
3：cDNA的甲基化
• 3 . 1.在cDNA样品中加入以下试剂： 2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl 5 mol/L NaCl 2μl 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl 20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl 加H2O至 96μl 3 . 2.取出两小份样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中,分别编为1号和2号, 置于冰上. 3 . 3.在余下的反应混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶（80 000单位/ml）, 保存在0℃直至步骤4完成. 3 . 4.再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品（各2μl）至0.5ml微量离 心管中,分别编为3号和4号.
• 6 . 4.预备适当的大肠杆菌株新鲜过夜培养物,包装混合物做100倍 稀释,各取10μl和100μl涂板,于37℃或42℃培养8~12小时. 6 . 5.计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑,连接反应A不应产生重组噬 菌斑,而连接反应B、C和D应产生数目递增的重组噬菌斑. 6 . 6.根据重组噬菌斑的数目,计算cDNA的克隆效率. 6 . 7.挑取12个重组λ噬菌体空斑,小规模培养裂解物并制备DNA,以 供适当的限制性内切核酸酶消化. 6 . 8.通过1%琼脂凝胶电泳分析cDNA插入物的大小,用长度范围 500bp~5kb的DNA片段作为分子质量参照.
• 5 . 5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体,将cDNA加到柱 上（体积50μl或更小）,放开止血钳,使cDNA进入凝胶.用50μl TE(pH7.6)洗 涤盛装cDNA的微量离心管,将洗液亦加于柱上.用含0.1 mol/L NaCl的 TE(pH7.6)充满泡沫管. 5 . 6.用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程.放射性cDNA流到柱 长2/3时,开始用微量离心管收集,每管2滴,直至将所有放射性洗脱出柱为止. 5 . 7.用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性. 5 . 8.从每一管中取出一小份,以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb）的 DNA片断作标准参照物,通过1%琼脂凝胶电泳进行分析,将各管余下部分 贮存于-20℃,直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片.
• 接头-衔接子与cDNA的连接
• 4.8.将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中： 10×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 2μl 800~1000 ng的磷酸化接头或衔接子 2μl T4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml） 1μl 10 mmol/L ATP 2μl 混匀后,在16℃温育8~12h. 4.9.从反应液中吸出0.5μl贮存于4℃,其余反应液于68℃ 加热15min以灭活连接酶.
5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法 分离cDNA
•
Sepharose CL-4B柱的制备 5 . 1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部,用 无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去,再用滤过的压缩空气将余下的棉 拭子吹至吸管狭窄端. 5 . 2.将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连,将吸管宽端浸于含有 0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中.将聚氯乙烯管与相连于真空装置的 锥瓶相接.轻缓抽吸,直至吸管内充满缓冲液,用止血钳关闭软管.