利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
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分泌型重组人胰岛素表达法
上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编 码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型 重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式 存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰 岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常 能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效 表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序 减轻了负担。
确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工艺路线生 产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。
为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第 二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
tac Met
Apr ori
人胰岛素的生产方法
化学转型法制人胰岛素
猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素 与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人 的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种 选择。
上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催 化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B 链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙 酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60% 但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链同时表达法
tac Met
转化
b-Gal
Apr
Met
M
N
B peptide
A peptide
ori
化学合成AB链编码序列
体外折叠
重组人胰岛素
分离纯化
M C
CNBr 处理
特异性裂解
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：
直接提取法制人胰岛素
早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料 供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临 床需求。
人胰岛素的生产方法
化学合成法制人胰岛素
根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这 条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产 成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
胰岛素的结构及其生物合成
N
信号肽
B肽
C肽 信号肽酶
C
A肽
C 肽（31）
K R
SS
A 肽（21）
S
S
N
SS N
S S N
R R
C S S
B 肽（30） 高尔基体内的特异性肽酶
C S S
C
人胰岛素的生产方法
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
基因工程菌的构建战略： tac Met
化学合成A链 和B链的编码 Apr 序列
b-Gal Met Apr
A peptide ori
tac Met
b-Gal Met
B peptide ori
M N
M C
M N
M C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
SS
S A peptide
S
B peptide
R R
CK S S
Rቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
羧肽酶B
CNBr
胰蛋白酶
SS
N S S
N
C
S
S
R
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
生产技术的评价：
在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成 良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高 达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷， 而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上 弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。
A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
M N
b-Gal A
M C
M N
b-Gal B
M C
CNBr 处理
N
CN C
N CN
C
分离纯化
Cys 体外氧化和重折叠
SS N
S S N
C S S
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
生产技术的评价： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正
b-Gal
Met B peptide C peptide A peptide
人胰岛素原的cDNA
转化
M N
分离纯化
M C
重组人胰岛素原
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
表达产物的后处理路线：
B链中第22位上的Arg和第29
R
位上的Lys由于良好折叠的原
因，对胰蛋白酶不敏感
M
N
C peptide
人胰岛素的生产方法
基因工程法制人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛 素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司 又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。
上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合 性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代 动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫 原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域 中的巨大潜力。
上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编 码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型 重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式 存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰 岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常 能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效 表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序 减轻了负担。
确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工艺路线生 产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。
为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第 二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
tac Met
Apr ori
人胰岛素的生产方法
化学转型法制人胰岛素
猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素 与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人 的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种 选择。
上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催 化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B 链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙 酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60% 但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链同时表达法
tac Met
转化
b-Gal
Apr
Met
M
N
B peptide
A peptide
ori
化学合成AB链编码序列
体外折叠
重组人胰岛素
分离纯化
M C
CNBr 处理
特异性裂解
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：
直接提取法制人胰岛素
早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料 供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临 床需求。
人胰岛素的生产方法
化学合成法制人胰岛素
根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这 条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产 成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
胰岛素的结构及其生物合成
N
信号肽
B肽
C肽 信号肽酶
C
A肽
C 肽（31）
K R
SS
A 肽（21）
S
S
N
SS N
S S N
R R
C S S
B 肽（30） 高尔基体内的特异性肽酶
C S S
C
人胰岛素的生产方法
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
基因工程菌的构建战略： tac Met
化学合成A链 和B链的编码 Apr 序列
b-Gal Met Apr
A peptide ori
tac Met
b-Gal Met
B peptide ori
M N
M C
M N
M C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
SS
S A peptide
S
B peptide
R R
CK S S
Rቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
羧肽酶B
CNBr
胰蛋白酶
SS
N S S
N
C
S
S
R
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
生产技术的评价：
在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成 良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高 达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷， 而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上 弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。
A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
M N
b-Gal A
M C
M N
b-Gal B
M C
CNBr 处理
N
CN C
N CN
C
分离纯化
Cys 体外氧化和重折叠
SS N
S S N
C S S
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
生产技术的评价： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正
b-Gal
Met B peptide C peptide A peptide
人胰岛素原的cDNA
转化
M N
分离纯化
M C
重组人胰岛素原
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
表达产物的后处理路线：
B链中第22位上的Arg和第29
R
位上的Lys由于良好折叠的原
因，对胰蛋白酶不敏感
M
N
C peptide
人胰岛素的生产方法
基因工程法制人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛 素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司 又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。
上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合 性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代 动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫 原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域 中的巨大潜力。