原发性肝癌患者血浆循环游离线粒体DNA定量分析及其诊断意义

原发性肝癌患者血浆循环游离线粒体DNA定量分析及其诊断

意义

乔录新;王贲士;陈德喜;石英;郭洪亮

【摘要】目的分析血浆循环游离线粒体DNA(CCF mtDNA)水平与原发性肝癌(HCC)的相关性,探讨其作为HCC标志物的可行性.方法收集HCC患者及体检健康者的血浆标本各60例,提取全基因组DNA;实时荧光定量PCR分析线粒体CoⅡ一段保守且与核基因组无同源的序列;构建含该靶序列的已知浓度的质粒作为标准品,系列稀释后定量检测CCF mtDNA的含量;独立样本t检验分析HCC患者与体检健康者CCF mtDNA水平的差异;ROC曲线分析CCF mtDNA诊断HCC的效能.结果HCC患者CCF mtDNA水平[(0.591 ±0.014) ×106拷贝/mL]显著高于健康对照组[(0.364±0.012)×106拷贝/mL],差异有统计学意义(t=12.27,P＜0.05);ROC曲线结果显示,以0.470×106拷贝/mL为cut off值,CCF mtDNA诊断HCC的敏感性为83.3％,特异性为88.3％;ROC曲线下面积(AUCROC)=0.916,95％ CI:0.864～0.968,P＜0.05.结论 HCC患者CCFmtDNA水平升高,且诊断HCC的敏感性、特异性较高,可能作为肿瘤标志物用于HCC诊断.

【期刊名称】《临床检验杂志》

【年(卷),期】2015(033)001

【总页数】3页(P40-42)

【关键词】肝癌;血浆;循环游离线粒体DNA;实时荧光定量聚合酶链反应

【作者】乔录新;王贲士;陈德喜;石英;郭洪亮

【作者单位】首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所,北京100069;山

东省肿瘤医院外科,济南250117;济南大学山东医学科学院与生命科学学院,济南250022;首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所,北京100069;首都医

科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所,北京100069;山东省肿瘤医院外科,济

南250117;济南大学山东医学科学院与生命科学学院,济南250022

【正文语种】中文

【中图分类】R735.7

人类细胞中包含数千拷贝数的线粒体DNA(mtDNA)，研究发现,其数量及序列的

变异与神经退行性疾病、糖尿病及其并发症、肥胖症、癌症、艾滋病并发症和老化等机体多种疾病状态密切相关[1]。线粒体是细胞内负责能量代谢和细胞内环境稳

定的细胞器，其功能障碍被视为癌症的标志[1]。近年来循环无细胞线粒体

DNA(circulating cell- free mitochondrial DNA，CCF mtDNA)的水平改变在卵巢癌、尤文氏肉瘤、泌尿系恶性肿瘤、乳腺肿瘤、睾丸癌等肿瘤中均被检测出[2]，有学者建议可将其作为一种良好的非侵入性诊断或预后判断的生物学标志物[3]。

血清CCF mtDNA检测由于方法简便，对患者无创伤，因此具有广泛的应用前景[4]。目前，国内尚未见肝细胞癌(HCC)患者血清CCF mtDNA检测的报道。本研

究通过检测HCC患者和体检健康者血清CCF mtDNA的表达水平，探讨其作为HCC非侵入性诊断标志物的可行性。

1.1 研究对象收集2013年4～10月北京佑安医院外二科就诊的初诊HCC患

者60例。男37例，女23例。年龄23～78岁，平均(50.0±2.1)岁。依据卫生部2011年颁布的《原发性肝癌诊疗规范》[5]，患者纳入标准为原发性肝癌首次确诊，满足手术治疗条件，且未经过任何放、化疗。排除标准为排除合并冠心病、心肌病、血液性疾病、严重肝肾功能不全、急性脑血管疾病等，或治疗前接受输血治疗。收

集同期就诊的体检健康者60例，男32例，女18例。年龄24～71岁，平均(49.0±1.8)岁。本研究获北京佑安医院医学伦理学委员会的批准，研究对象签署知

情同意书。

1.2 标本采集采集HCC患者入院后手术治疗前及体检健康者的空腹静脉血5 mL， EDTA-K2抗凝，2 500 r/min离心10 min，分装后置-80 ℃保存。

1.3 主要试剂和仪器DNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；BamH Ⅰ和

Xho Ⅰ酶(TaKaRa公司)；琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、快速T4 DNA连接试剂盒(北京博迈德公司)；高纯度质粒小量快速提取试剂盒(北京百泰克公司)；Fast SYBR Green Master Mix 及7900 H Real time PCR仪(Applied Biosystems公司)； PCR扩增仪及DYY-6C型电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Tanon1600R型凝

胶成像仪(上海天能公司)。

1.4 标准品载体的构建根据GenBank中COⅡ片段序列(NC_012920)，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，由上海生工公司合成。COⅡ上游引物序列：5′-ATGGCACATGCAGCGCAAGT-3′，下游引物序列：5′-GGTAAATACGGGCCCTATTTC-3′。扩增片段长度为678 bp。PCR反应总体系

为50 μL：包括10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，200 μmol/L上、下游引物各1 μL，2.5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 36.5 μL。循

环参数：94 ℃ 2 min; 94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。将扩增后的片段送北京博迈德公司测序，测序序列与COⅡ片段序列比对，证实为线粒体DNA上COⅡ片段。按琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒说明书操作

将扩增产物进行切胶回收纯化。纯化回收后的片段与pMD-18T载体连接，按质

粒提取试剂盒说明书操作进行质粒提取，质粒用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。

酶切产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳并送北京博迈德公司测序验证及比对。

1.5 基因组DNA提取及实时荧光定量PCR 取各研究对象血浆200 μL，按照