琼脂稀释法操作步骤ppt课件
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按当年的CLSI/NCCLS标准判断结果。
22
质控菌株
质控菌株
药敏
金黄色葡萄球菌
ATCC29213
+
大肠埃希菌
ATCC25922
+
大肠埃希菌
ATCC35218
+
肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌
ATCC700603
+
ATCC27853
+
其他
产β内酰胺酶 产超广谱β内酰胺酶
23
质控菌株
质控菌株
肺炎链球菌 粪肠球菌
流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌
ATCC49619 ATCC29212 ATCC49766 ATCC49247
淋病柰瑟球菌：
厌氧菌
ATCC49226 ATCC25285
药敏
+ + + + +
其他
检测胸腺嘧啶 氨苄西林敏感株 产β内酰胺酶(-) 氨苄西林耐药株
24
常见问题及解决指南
抗菌药 氨基糖苷类 喹诺酮类 多种药物
3
抗菌药物保存液的准备2
抗菌药物稀释 选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释,
稀释液需要量见下列公式：
抗菌药物实际称量*效价
稀释液体积= 保存液浓度（1920ug/ml）
4
抗菌药物保存液的准备3
实际操作： 先计算完成一批试验需几次完成,每次用量
多少,然后可一起称量,一起稀释,然后按每 次需要量分装在试管中,贴上标签,注明药 物名称,浓度,体积数及配制日期,置与≤20℃保存,备用。
现象 MIC太高 MIC太低 跳管
可能原因
解决办法
培养基PH太低 培养基PH太高
PH范围7.2-7.4。避 免CO2孵育降低PH
PH范围7.2-7.4。
污染、管内接种物不 重复QC试验 正确、药物浓度错误、 使用新批号培养基 肉汤体积错误
25
26
抗菌药物最小称量=
27
9
菌液准备4
如一次实验需完成50株或100株细菌,则细 菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果 记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种 编号
10
琼脂稀释法药敏平板的制备 1
配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、 厌氧菌等特殊细菌的培养基,待冷却到4850℃，浇制药物平板。
取灭菌的90mm平板12只,用记号笔在平 板底部作好“点种标记”、“药物名称”、 “药物浓度”,浓度从0.06ｕg/ml……128 ｕg/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列。
无菌环取单个菌落 接种于无菌肉汤/生理盐水内 校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml 推荐用于苛氧菌和潜在的MRS
8
菌液准备3
对绝大多数细菌来说,上述用生长法或直接 菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬液, 应该再用无菌肉汤或生理盐水行1:10稀释, 此时菌液浓度为1-2*107CFU/ml,调整好 的菌液应该在制备后的15分钟内完成点种
准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照
所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉眼 可见的水珠(可在35℃孵箱内倒置平板开 盖烘干15-20分钟)
14
琼脂稀释法药敏平板的制备5
如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平 板,则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻 璃试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml
15
测试菌液的点种1
预先将点种针和点种板高压灭菌,并在孵箱内烘干 （52孔、100孔、或21孔）
将已调整好浊度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量 加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔内,并作好 与药物平板相应的点种标记,一般每小孔内应加入 菌液270ｕl。每批试验均须保留有质控菌位置和 无菌菌液位置
淋病奈瑟球菌需5%CO2空气环境中孵育20-24 小时，阅读结果
21
结果阅读和判断
结果阅读时，平板应置于黑色不反光的表面上， 记录的MIC是完全抑制细菌生长的最低抗生素浓 度，单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象 可忽略不计。
如果在MIC判断终点附近持续存在或多个菌落， 或者低浓度不长，高浓度生长；或者有俗称的跳 管现象，就应该检查试验菌的纯度，有否污染菌 生长，并尽可能重复试验。
琼脂稀释法操作步骤
1
原理：
将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128ｕ g/ml 、64ｕg/ml 、32ｕg/ml ……0.06 ｕg/ml对倍稀释的浓度系列
多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点 种到琼脂表面,经35℃16-20小时培养
肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板的 最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)
2
抗菌药物保存液的准备1
估算抗菌药物最小称量 琼脂稀释法最高药物浓度为128ｕg/ml 药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成
15倍稀释，因此保存液为 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml
如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/ml*10ml
抗菌药物的效价
移液管内剩余的1.5ml加入到960标记的试管内, 混匀后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml标记的平 板内1ml
移液管内剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml标记 的玻璃试管内;混匀后再吸取2.5ml
依次类推,直至最后一个0.06ｕg/ml标记的平皿 内加入1ml,则抗菌药物稀释完成
13
琼脂稀释法药敏平板的制备4
5
培养基
需氧菌 苛氧菌
厌氧菌
MH肉汤或琼脂 嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158 链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血 卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血 淋球菌：CC Agar Base+L53 Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
6
菌液准备1
生长法： 无菌环取4-5个菌落大小形态一致的菌落
顶部后接种于4-5mlMH肉汤内 35℃ 培养4-6小时到对数生长期，亦可过
夜培养,但不允许超过18小时 用肉汤/生理盐水校正至0.5麦氏管浓度1-
2X108CFU/ml
7
菌液准备2
直接菌落悬浮法： 从孵育了18-24h新鲜培养物的平板上，用
17
18
19
20
药物平板的孵育
上述接种好的平板应在室温下静置至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒置，于 35℃孵育16-20小时
如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35℃， 绝对不能超过35℃，孵育24小时，阅读结果
万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果
11
琼脂稀释法药敏平板的制备2
取11支无菌玻璃试管(13Χ100mm),每支 试管标记为： 960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1.87 5,0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用无 菌移液管加无菌稀释液1.5ml
12
琼脂稀释法药敏平板的制备3
将保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml浓度的 抗菌药物保存液取出融化后,用无菌移液管吸取 2.5ml加入到128ｕg/ml标记的平板内1ml
用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装在 多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板安置 上多点接种器的点种板位置上
16
测试菌液的点种2
开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ｕl，所以接种量为104 CFU/点
点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板
22
质控菌株
质控菌株
药敏
金黄色葡萄球菌
ATCC29213
+
大肠埃希菌
ATCC25922
+
大肠埃希菌
ATCC35218
+
肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌
ATCC700603
+
ATCC27853
+
其他
产β内酰胺酶 产超广谱β内酰胺酶
23
质控菌株
质控菌株
肺炎链球菌 粪肠球菌
流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌
ATCC49619 ATCC29212 ATCC49766 ATCC49247
淋病柰瑟球菌：
厌氧菌
ATCC49226 ATCC25285
药敏
+ + + + +
其他
检测胸腺嘧啶 氨苄西林敏感株 产β内酰胺酶(-) 氨苄西林耐药株
24
常见问题及解决指南
抗菌药 氨基糖苷类 喹诺酮类 多种药物
3
抗菌药物保存液的准备2
抗菌药物稀释 选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释,
稀释液需要量见下列公式：
抗菌药物实际称量*效价
稀释液体积= 保存液浓度（1920ug/ml）
4
抗菌药物保存液的准备3
实际操作： 先计算完成一批试验需几次完成,每次用量
多少,然后可一起称量,一起稀释,然后按每 次需要量分装在试管中,贴上标签,注明药 物名称,浓度,体积数及配制日期,置与≤20℃保存,备用。
现象 MIC太高 MIC太低 跳管
可能原因
解决办法
培养基PH太低 培养基PH太高
PH范围7.2-7.4。避 免CO2孵育降低PH
PH范围7.2-7.4。
污染、管内接种物不 重复QC试验 正确、药物浓度错误、 使用新批号培养基 肉汤体积错误
25
26
抗菌药物最小称量=
27
9
菌液准备4
如一次实验需完成50株或100株细菌,则细 菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果 记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种 编号
10
琼脂稀释法药敏平板的制备 1
配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、 厌氧菌等特殊细菌的培养基,待冷却到4850℃，浇制药物平板。
取灭菌的90mm平板12只,用记号笔在平 板底部作好“点种标记”、“药物名称”、 “药物浓度”,浓度从0.06ｕg/ml……128 ｕg/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列。
无菌环取单个菌落 接种于无菌肉汤/生理盐水内 校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml 推荐用于苛氧菌和潜在的MRS
8
菌液准备3
对绝大多数细菌来说,上述用生长法或直接 菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬液, 应该再用无菌肉汤或生理盐水行1:10稀释, 此时菌液浓度为1-2*107CFU/ml,调整好 的菌液应该在制备后的15分钟内完成点种
准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照
所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉眼 可见的水珠(可在35℃孵箱内倒置平板开 盖烘干15-20分钟)
14
琼脂稀释法药敏平板的制备5
如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平 板,则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻 璃试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml
15
测试菌液的点种1
预先将点种针和点种板高压灭菌,并在孵箱内烘干 （52孔、100孔、或21孔）
将已调整好浊度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量 加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔内,并作好 与药物平板相应的点种标记,一般每小孔内应加入 菌液270ｕl。每批试验均须保留有质控菌位置和 无菌菌液位置
淋病奈瑟球菌需5%CO2空气环境中孵育20-24 小时，阅读结果
21
结果阅读和判断
结果阅读时，平板应置于黑色不反光的表面上， 记录的MIC是完全抑制细菌生长的最低抗生素浓 度，单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象 可忽略不计。
如果在MIC判断终点附近持续存在或多个菌落， 或者低浓度不长，高浓度生长；或者有俗称的跳 管现象，就应该检查试验菌的纯度，有否污染菌 生长，并尽可能重复试验。
琼脂稀释法操作步骤
1
原理：
将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128ｕ g/ml 、64ｕg/ml 、32ｕg/ml ……0.06 ｕg/ml对倍稀释的浓度系列
多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点 种到琼脂表面,经35℃16-20小时培养
肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板的 最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)
2
抗菌药物保存液的准备1
估算抗菌药物最小称量 琼脂稀释法最高药物浓度为128ｕg/ml 药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成
15倍稀释，因此保存液为 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml
如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/ml*10ml
抗菌药物的效价
移液管内剩余的1.5ml加入到960标记的试管内, 混匀后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml标记的平 板内1ml
移液管内剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml标记 的玻璃试管内;混匀后再吸取2.5ml
依次类推,直至最后一个0.06ｕg/ml标记的平皿 内加入1ml,则抗菌药物稀释完成
13
琼脂稀释法药敏平板的制备4
5
培养基
需氧菌 苛氧菌
厌氧菌
MH肉汤或琼脂 嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158 链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血 卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血 淋球菌：CC Agar Base+L53 Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
6
菌液准备1
生长法： 无菌环取4-5个菌落大小形态一致的菌落
顶部后接种于4-5mlMH肉汤内 35℃ 培养4-6小时到对数生长期，亦可过
夜培养,但不允许超过18小时 用肉汤/生理盐水校正至0.5麦氏管浓度1-
2X108CFU/ml
7
菌液准备2
直接菌落悬浮法： 从孵育了18-24h新鲜培养物的平板上，用
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18
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药物平板的孵育
上述接种好的平板应在室温下静置至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒置，于 35℃孵育16-20小时
如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35℃， 绝对不能超过35℃，孵育24小时，阅读结果
万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果
11
琼脂稀释法药敏平板的制备2
取11支无菌玻璃试管(13Χ100mm),每支 试管标记为： 960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1.87 5,0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用无 菌移液管加无菌稀释液1.5ml
12
琼脂稀释法药敏平板的制备3
将保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml浓度的 抗菌药物保存液取出融化后,用无菌移液管吸取 2.5ml加入到128ｕg/ml标记的平板内1ml
用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装在 多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板安置 上多点接种器的点种板位置上
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测试菌液的点种2
开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ｕl，所以接种量为104 CFU/点
点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板