用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒及检测方

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321501.3
(22)申请日 2017.05.09
(71)申请人 广东顺德工业设计研究院（广东顺
德创新设计研究院）
地址 528300 广东省佛山市顺德区北滘镇
广东工业设计城设计广场二期B2区三
层
(72)发明人 高应棋　漆彦斌　刘华敏　王光勇　
黄书贵　
(74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理
有限公司 44224
代理人 林青中
(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)
C12Q 1/04(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)C12N 15/66(2006.01)C12N 15/70(2006.01) (54)发明名称
用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其
构建方法、试剂盒及检测方法
(57)摘要
本发明公开了一种用于检测支原体的PCR引
物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒及检测方法。

本发明创造性地通过比较选择不同种别的支原
体中所共有的保守序列进行PCR引物的设计选
择，设计特异性的P C R 引物用于扩增支原体
16sRNA和23sRNA间的间隔区的一端基因片段，
该基因片段涵盖多数的支原体种别，因而可以用于
针对多种别的支原体进行PCR扩增检测。

并且由
于各种别间隔区基因结构不同，从而可以根据扩
增产物的大小和酶切部位的不同，作为鉴别种别
的根据，为支原体的种别鉴定提供了技术支持。

该用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构
建方法、试剂盒及检测方法灵敏度和检测准确性
高，
可广泛推广应用于支原体的检测。

权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图3页CN 106939353 A 2017.07.11
C N 106939353
A
1.一种用于检测支原体的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一种用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，使用含限制性内切酶识别位点序列及SEQ ID NO:1所示序列的上游引物和含限制性内切酶识别位点序列及SEQ ID NO:2所示序列的下游引物对含有支原体的模板进行PCR扩增，并将PCR扩增得到的产物酶切后转入同样酶切的表达载体中，得到的连接产物转化细菌细胞，筛选阳性克隆，提取质粒即得。

3.如权利要求2所述的用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，所述上游引物中限制性内切酶识别位点序列为BamH I识别位点序列，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示；所述下游引物中限制性内切酶识别位点序列为Ecor I识别位点序列，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示。

4.如权利要求3所述的用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，PCR扩增程序为：95℃变性2～5min后进入循环，循环的参数为95℃，30s；58℃，30s；72℃，30～40s，30～40个循环后在72℃延伸5～7min。

5.如权利要求3所述的用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，所述表达载体是pc DNA 3.1(+)。

6.如权利要求5所述的用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，其特征在于，在将PCR 扩增得到的产物酶切后转入同样酶切的表达载体中时，将PCR扩增得到的产物与表达载体分别酶切后，再按照物质的量8～3:1的比例将酶切后的PCR扩增得到的产物与酶切后的表达载体混合，并加入T4DNA连接酶进行连接反应。

7.一种用于检测支原体的阳性质粒，其特征在于，采用如权利要求2～6中任一项所述的构建方法构建得到。

8.一种用于检测支原体的试剂盒，其特征在于，包括含有PCR引物的试剂和阳性质粒，所述含有PCR引物的试剂中的PCR引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述阳性质粒为权利要求7所述的用于检测支原体的阳性质粒。

9.如权利要求8所述的用于检测支原体的试剂盒，其特征在于，所述含有PCR引物的试剂中PCR引物的浓度是4μM，所述含有PCR引物的试剂中还含有1～1.5U的Taq DNA聚合酶、浓度为150～200μM的dNTP以及浓度为1.8～2.5mM的Mg 2+。

10.一种细胞培养时支原体的检测方法，其特征在于，使用如权利要求8或9所述的用于检测支原体的试剂盒，所述检测方法包括如下步骤：
直接将待测细胞培养样品与所述含有PCR引物的试剂混合，进行PCR扩增；
以所述阳性质粒为模板与所述含有PCR引物的试剂混合，进行PCR扩增；比较所述待测细胞培养样品与所述阳性质粒的PCR扩增结果。

权　利　要　求　书1/1页CN 106939353 A
用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒
及检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒及检测方法。

背景技术
[0002]支原体(Mycoplasma)也称作霉形体，其是一类缺乏细胞壁的原核微生物。

支原体介于细菌和病毒之间，可在无生命培养基中生长繁殖，其结构简单、个体微小，形态成分枝状或丝状，能通过一般的微孔滤膜滤器(0.22-0.45μm)。

自1956年Robinson等首次从细胞培养中分离出支原体以来，国内外关于支原体污染细胞和疫苗等生物制品的报道屡见不鲜，细胞培养物被支原体污染成为了极普遍的问题。

[0003]Kuppeve等应用多种检测方法发现欧洲各实验室的细胞系均有不同程度的支原体污染。

在中国，中国医学科学院基础医学研究所通过检测发现国内来源的细胞株系受支原体污染率达到60％。

目前已知有20多种支原体可以造成细胞培养的污染，其中又以口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾原体和猪鼻支原体5种支原体为主。

在细胞培养过程中，工作环境、实验器材、培养基及操作者本身都是污染的来源，因此都会存在支原体污染的风险。

而支原体污染后会与细胞长期共存，对细胞生长产生不同程度的抑制作用，改变生产细胞的目的基因及其蛋白的表达，也会造成细胞转染效率降低，并且在污染的后期导致细胞变形，对教学、科研以及生产都会产生严重的影响。

因此，检测细胞培养中支原体污染十分必要，且应该进行定期检测监控。

[0004]用于检测细胞培养中支原体污染的方法有多种，常用的有分离培养法、DNA荧光染色法、PCR法、探针法、ELISA等多种方法。

其中PCR技术作为一种快速、灵敏、特异且简便的基因诊断技术已广泛应用于科学研究和疾病的诊断。

1989年首次报告有应用PCR方法检测诊断支原体感染，随后不断出现用PCR方法检测各种支原体。

至今很多检测支原体的PCR方法在引物选择上都使用16s rRNA序列的保守区，但若使用一步法PCR，这些设计的引物都难以避免与生态学上相关的细菌有交叉反应，出现假阳性的结果，又或者出现部分特异性好的引物不能扩增出多数常见支原体的DNA，而出现假阴性结果。

发明内容
[0005]基于此，有必要提供一种检测准确性高、且能够用于多种别支原体检测的用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒及检测方法。

[0006]本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

[0007]一种用于检测支原体的PCR引物，所述PCR引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

[0008]本发明创造性地通过比较选择不同种别的支原体中所共有的保守序列进行PCR引物的设计选择，设计特异性的PCR引物用于扩增支原体16sRNA和23sRNA间的间隔区的一端
基因片段(序列如SEQ ID NO:5所示)，该基因片段涵盖多数的支原体种别，因而可以用于针对多种别的支原体进行PCR扩增检测。

并且由于各种别间隔区基因结构不同，从而可以根据扩增产物的大小和酶切部位的不同，作为鉴别种别的根据，为支原体的种别鉴定提供了技术支持。

[0009]一种用于检测支原体的阳性质粒的构建方法，使用含限制性内切酶识别位点序列及SEQ ID NO:1所示序列的上游引物和含限制性内切酶识别位点序列及SEQ ID NO:2所示序列的下游引物对含有支原体的模板进行PCR扩增，并将PCR扩增得到的产物酶切后转入同样酶切的表达载体中，得到的连接产物转化细菌细胞，筛选阳性克隆，提取质粒即得。

[0010]在其中一个实施例中，所述上游引物中限制性内切酶识别位点序列为BamH I识别位点序列，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示；所述下游引物中限制性内切酶识别位点序列为Ecor I识别位点序列，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示。

[0011]在其中一个实施例中，PCR扩增程序为：95℃变性2～5min后进入循环，循环的参数为95℃，30s；58℃，30s；72℃，30～40s，30～40个循环后在72℃延伸5～7min。

[0012]在其中一个实施例中，所述表达载体是pc DNA 3.1(+)。

[0013]在其中一个实施例中，在将PCR扩增得到的产物酶切后转入同样酶切的表达载体中时，将PCR扩增得到的产物与表达载体分别酶切后，再按照物质的量8～3:1的比例将酶切后的PCR扩增得到的产物与酶切后的表达载体混合，并加入T4DNA连接酶进行连接反应。

[0014]在其中一个实施例中，所述细菌细胞为E.coli DH5α感受态细胞。

[0015]一种用于检测支原体的阳性质粒，采用上述任一实施例所述的构建方法构建得到。

[0016]一种用于检测支原体的试剂盒，包括含有PCR引物的试剂和阳性质粒，所述含有PCR引物的试剂中的PCR引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述阳性质粒为上述用于检测支原体的阳性质粒。

[0017]在其中一个实施例中，所述含有PCR引物的试剂中PCR引物的浓度是4μM，所述含有PCR引物的试剂中还含有1～1.5U的Taq DNA聚合酶、浓度为150～200μM的dNTP以及浓度为1.8～2.5mM的Mg2+。

[0018]一种细胞培养时支原体的检测方法，使用上述用于检测支原体的试剂盒，所述检测方法包括如下步骤：
[0019]直接将待测的细胞培养样品与所述含有PCR引物的试剂混合，进行PCR扩增；[0020]以所述阳性质粒为模板与所述含有PCR引物的试剂混合，进行PCR扩增；[0021]比较所述待测的细胞培养样品与所述阳性质粒的PCR扩增结果。

[0022]在检测时(包括上述阳性质粒的构建时)，PCR扩增通过优化的PCR扩增程序，可以有效的扩增出所需的片段，如在其中一个实施例中，优化的PCR扩增程序为：95℃变性2～5min后进入循环，循环的参数为95℃，30s；58℃，30s；72℃，30～40s，30～40个循环后在72℃延伸5～7min。

[0023]上述用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒及检测方法灵敏度和检测准确性高，可检测出核酸含量低至103拷贝/μl以及稀释倍数高达64倍的受污染的细胞培养样品。

该试剂盒及检测方法使用简单，可以免去样品预处理(煮沸)节省操作时间和污染风险，操作简便，可大批量生产和推广应用于支原体尤其是细胞培养物中支原体的
检测。

附图说明
[0024]图1为16s rRNA和23s rRNA间的间隔区特异性片段获取电泳图，其中M为DNA maker，DNA Maker III；1、2均为阳性细胞样品模板；3为以ddH2O为模板的阴性对照。

[0025]图2为重组的阳性参照质粒ZYT-pcDNA的菌液PCR鉴定结果图，其中M为DNA maker，DNA Maker III；1～5：筛选后的菌液样品；6：以ddH2O为模板的阴性对照。

[0026]图3为重组质粒ZYT-pcDNA酶切鉴定图，其中M为DNA maker，DNA Maker I；1：Ecor I和BamH I两种内切酶双酶切的质粒ZYT-pcDNA；2：不酶切的质粒ZYT-pcDNA；3：以ddH2O为模板的阴性对照。

[0027]图4为基于阳性参照的灵敏度测试结果图，其中M为DNA maker，DNA Maker III；1：拷贝数为1.16×109拷贝/μl的阳性参照质粒；2：拷贝数为1.16×108拷贝/μl的阳性参照质粒；3：拷贝数为1.16×107拷贝/μl的阳性参照质粒；4：拷贝数为1.16×106拷贝/μl的阳性参照质粒；5：拷贝数为1.16×105拷贝/μl的阳性参照质粒；6：拷贝数为1.16×104拷贝/μl的阳性参照质粒；7：拷贝数为1.16×103拷贝/μl的阳性参照质粒；8：阴性对照。

[0028]图5为检测阳性细胞样品的灵敏度测试结果图，其中M为DNA maker，50kb DNA Ladder；1：稀释倍数为8倍的细胞样品；2：稀释倍数为16倍的细胞样品；3：稀释倍数为32倍的细胞样品；4：稀释倍数为64倍的细胞样品；5：阳性参照；6：阴性对照。

[0029]图6为预混PCR反应试剂2×Mycoplasma PCR Master mix对细胞培养物的检测分析结果图，其中M为DNA maker，DNA Maker I；1：受污染的细胞培养上清液(CHO)；2：受污染的细胞培养上清液(293T)；3：受污染的细胞悬液(Jurkat)；4：无污染的细胞培养上清液(CHO)；5：无污染的细胞培养上清液(293T)；6：无污染的细胞培养上清液(Jurkat)；7：无污染的细胞悬液(CHO)；8：无污染的细胞悬液(Jurkat)；9：阳性参照；10：阴性对照。

具体实施方式
[0030]为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。

附图中给出了本发明的较佳实施例。

但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。

相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

[0031]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0032]下述实施例中的实验材料，若无特别说明，均是来源于商业途径。

所述的实验方法，若无特别说明，均为通用实验方法。

[0033]实施例1：阳性质粒的构建与鉴定
[0034](1)16s rRNA和23s rRNA间的间隔区特异性片段的获取
[0035]以已知受支原体污染的细胞培养物为模板，利用引物P1/P2扩增16s rRNA和23s rRNA间的间隔区特异性片段，并在上下游中分别引入BamH I和Ecor I酶切位点，并在酶切
位点前添加5个保护性碱基，引物序列如下：
[0036]P1：5'-GATCAGAATTCGGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT-3'(SEQ ID NO:3)；
[0037]P2：5'-CATACGGATCCTGCACCATCTGTCACTCTGTTACCCTC-3'(SEQ ID NO:4)。

[0038]引物P1/P2扩增条件为：95℃变性2min后进入循环；循环参数为：95℃30s，58℃30s，72℃30s；35个循环后72℃延伸7min。

[0039]将图1所示的PCR产物纯化回收后于-20℃保存备用。

[0040](2)质粒ZYT-pcDNA的构建与鉴定
[0041]分别以扩增的16s rRNA和23s rRNA间的间隔区特异性片段和载体pcDNA3.1(+) (赛默飞公司)为底物，用BamH I和Ecor I双酶切后，两者按照物质的量比例为3:1混合，利用Takara公司的T4DNA Ligase按照使用说明于16℃下过夜连接。

连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，进行氨苄抗性平板筛选，进行菌液PCR(如图2)获得阳性质粒种菌。

阳性质粒种菌进行扩大培养，提取质粒，获得重组的阳性质粒ZYT-pcDNA。

[0042]用BamH I和Ecor I对获得的质粒进行酶切鉴定，结果如图3所示，并对该质粒进行序列测定，如SEQ ID NO:1所示，鉴定结果证实构建正确。

[0043]将菌液按3:1与石蜡混合，作种菌保存于-20℃。

[0044](3)阳性参照的获得
[0045]取保存的种菌扩大培养，按1:1000比例加入新的LB培养基中，培育16h后，提取质粒ZYT-pcDNA，溶于EB溶液中，作为阳性参照。

[0046]实施例2：预混PCR反应试剂2×Mycoplasma PCR Master mix的配制
[0047]将引物P3/P4按照4μM的浓度溶解于含有1U的Taq DNA聚合酶、150μM dNTP以及2.0mM Mg2+的mix溶液中，获得2×Mycoplasma PCR Master mix，其引物序列如下：[0048]P3：5'-GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT-3'(SEQ ID NO:1)；
[0049]P4：5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTACCCTC-3'(SEQ ID NO:2)。

[0050]实施例3：支原体检测试剂盒灵敏度分析
[0051](1)基于阳性参照质粒的灵敏度分析
[0052]将阳性质粒种菌进行扩大培养，提取质粒，利用DNA浓度测定仪测定质粒浓度。

根据公式：拷贝数(copies/μl)＝[(质粒浓度ng/μl×10-9)×(6.02×10 23)]÷(阳性参照质粒长度×660)，计算阳性参照质粒的拷贝数。

将阳性参照质粒按10倍梯度稀释，稀释倍数分别从10倍到107倍。

以各稀释倍数的阳性参照质粒为模板，利用2×Mycoplasma PCR Master mix进行PCR扩增，其反应体系如下：
[0053]
[0054]
[0055]PCR扩增条件为：95℃变性2min后进入循环；循环参数为：95℃30s，58℃30s，72℃30s；30个循环后72℃延伸7min。

[0056]PCR产物于2％琼脂糖凝胶上跑电泳，电压100V下进行40min。

于紫外下观察，本检测方法灵敏度高，在103拷贝/μl下仍可以扩增出270bp左右的目的条带，结果如图4。

[0057](2)基于阳性细胞样品的灵敏度分析
[0058]将阳性质粒按2倍梯度稀释，稀释倍数分别从4倍到64倍。

以各稀释倍数的阳性细胞样品为模板，利用2×Mycoplasma PCR Master mix进行PCR扩增，其反应体系如下：[0059]
组分体积(μl)
2×Mycoplasma PCR Master mix10
ddH2O8
模板(细胞样品或ddH2O)2
总体积20
[0060]PCR扩增条件为：95℃变性2min后进入循环；循环参数为：95℃30s，58℃30s，72℃30s；30个循环后72℃延伸7min。

[0061]PCR产物于2％琼脂糖凝胶上跑电泳，电压100V下进行40min。

于紫外下观察，本检测方法对细胞样品的灵敏度高，稀释64倍的阳性细胞样品仍可以扩增出270bp左右的目的条带，结果如图5。

[0062]上述实验结果表明：(1)本支原体检测方法的灵敏度高，可以检测出核酸含量低至103拷贝/μl以及稀释倍数高达64倍的受污染的细胞样品；(2)试剂盒操作方便，仅需按体系要求加入样品即可；(3)耗时短，2h左右即可获得检测结果。

[0063]实施例4预混PCR反应试剂2×Mycoplasma PCR Master mix对细胞培养物的检测分析
[0064]利用预混PCR反应试剂2×Mycoplasma PCR Master mix分别对确认受支原体污染的细胞培养上清液和细胞悬液、无支原体污染的细胞培养上清液及细胞悬液进行PCR扩增，其体系如下：
[0065]
组分体积(μl)
2×Mycoplasma PCR Master mix10
ddH2O8
模板(细胞样品或ddH2O)2
总体积20
[0066]PCR扩增条件为：95℃变性2min后进入循环；循环参数为：95℃30s，58℃30s，72℃30s；30个循环后72℃延伸7min。

[0067]PCR产物于2％琼脂糖凝胶上跑电泳，电压100V下进行40min。

于紫外下观察，确认受污染的3个细胞培养样品均可扩增出270bp左右的目的条带，确认无支原体污染的5个细胞培养样品均无扩增条带，如图6。

[0068]上述实验结果表明：本支原体检测试剂可适用于检测细胞培养的上清液或细胞悬液是否有支原体的污染，能扩增出目的条带的说明受支原体污染，无扩增条带的说明不受
支原体污染。

[0069]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0070]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。

应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING
<110> 广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院）
<120> 用于检测支原体的PCR引物、阳性质粒及其构建方法、试剂盒及检测方法<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggagcaaac aggattagta tccct 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcaccatct gtcactctgt taccctc 27
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatcagaatt cgggagcaaa caggattagt atccct 36
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catacggatc ctgcaccatc tgtcactctg ttaccctc 38
<210> 5
<211> 272
<212> DNA
<213> 天然序列
<400> 5
gggagcaaac aggattagta tccctggtag tccacgccgt aaacgatgat cattagttgg 60 tggaataatt tcactaacgc agctaacgcg ttaaatgatc cgcctgagta gtatgctcgc 120 aagagtgaaa cttaaaggaa ttgacgggaa cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 180 tttgaagata cgcgtagaac cttacccgct cttgacatct tctgcaaagc tatagagata 240
tagtggaggg taacagagtg acagatggtg ca 272
图1
图2
图3
图4
图5
图6。