一种绿色球状体(GGB)途径的槲蕨种苗组培快繁方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010447545.2
(22)申请日 2020.05.25
(71)申请人 中国科学院植物研究所
地址 100093 北京市海淀区香山南辛村20
号中国科学院植物研究所
(72)发明人 石雷　王頔　李东　
(74)专利代理机构 北京智为时代知识产权代理
事务所(普通合伙) 11498
代理人 王加岭　杨静
(51)Int.Cl.
A01H 4/00(2006.01)
(54)发明名称
一种绿色球状体(GGB)途径的槲蕨种苗组培
快繁方法
(57)摘要
本发明提供一种绿色球状体(GGB)途径的槲
蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，包括如下步
骤：外植体的消毒；GGB的诱导；GGB的增殖培养；
GGB的分化培养；芽丛切分；幼孢子体培养。

本发
明在获得槲蕨GGB后，在GGB的增殖培养中，通过
降低细胞分裂素的使用，以及使用黑暗条件，明
显改善了在光照条件下GGB因分化而造成的增殖
效率降低，提高了GGB的增殖速度，又降低了光能
的使用成本。

槲蕨GGB分化产生芽丛后，切分芽丛
得到的幼嫩孢子体的根状茎极小，而培养根状茎
使其达到可以出瓶的体积所需时间较长，本发明
通过在培养基中添加较高浓度的蔗糖处理幼孢
子体，大大提高了后期根状茎的生长速度，进而
缩短了种苗的繁殖周期。

权利要求书1页 说明书5页CN 111406652 A 2020.07.14
C N 111406652
A
1.一种绿色球状体(GGB)途径的槲蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：外植体的消毒；GGB的诱导；GGB的增殖培养；GGB的分化培养；芽丛切分；幼孢子体培养。

2.如权利要求1所述的槲蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，外植体的消毒包括如下步骤：选择生长健壮的槲蕨根状茎为外植体，将根状茎置于洗洁精溶液中浸泡5～10min，在流水下冲洗30～60min，待不产生泡沫后捞出用滤纸吸干表面水分，以75％酒精溶液浸泡30s，然后迅速放入0.1％升汞溶液中表面消毒6～8min，最后用无菌水冲洗3～5次。

3.如权利要求2所述的槲蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，作为外植体的槲蕨根状茎为生长季节当年生的根状茎。

4.如权利要求1所述的槲蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，GGB的诱导包括如下步骤：以1/2MS+2.0mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂为诱导培养基，将消毒后的根状茎切成0.5cm 长的小段，接种至诱导培养基中，置于培养室培养。

5.如权利要求1所述的槲蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，GGB的增殖培养包括如下步骤：将诱导得到的GGB转接于增殖培养基中，置于培养室中避光培养，增殖培养基为1/2MS +1.0～2.0mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂。

6.如权利要求1所述的槲蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，GGB的分化培养和芽丛切分包括如下步骤：将GGB接种于分化培养基中，置于培养室中培养，分化培养基为1/2MS+3％蔗糖+0.7％琼脂，待GGB分化产生大量丛生芽后，将丛生芽反复切分并继代接种于分化培养基中。

7.如权利要求1所述的槲蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，幼孢子体培养包括如下步骤：将得到的独立幼孢子体接种于MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，20-40天后转接至含有6％～8％蔗糖的基本培养基中，置于培养室培养20-30天，然后将幼孢子体转接至MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中继续培养。

8.如权利要求1-7任一项所述的槲蕨种苗组培快繁方法，其特征在于，培养条件为：培养室温度为24±1℃，光照强度为50～60μmoL/(m 2·s)，光周期为14/10h，相对湿度为30％，在GGB增殖培养中避光处理需在培养皿上覆盖锡箔纸或双层黑布。

权　利　要　求　书1/1页CN 111406652 A
一种绿色球状体(GGB)途径的槲蕨种苗组培快繁方法
技术领域
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种通过绿色球状体途径获得槲蕨组培苗的方法。

背景技术
[0002]绿色球状体(Green Globular Body，GGB)是蕨类组织培养体系中出现的一种特殊结构，通常为由众多绿色颗粒组成的球状体，因此得名。

GGB在诱导培养基中可不断增殖，改变培养基成分可使其迅速分化出幼苗，具有增殖倍率高、分化快、成苗周期短的特点。

因此，利用GGB进行蕨类植物种苗的繁殖有着巨大的发展前景。

目前，多种蕨类植物已建立GGB组培快繁途径，如鹿角蕨(叶秀仙等，2020)、笔筒树(张艳等，2020)、华南紫萁(陶佩琳和高政平，2019)、光叶蕨(胡进耀等，2018)、凤丫蕨(何俊等，2016)等。

[0003]槲蕨(Drynaria roosii)，又名石岩姜、岩连姜、猴姜，属于槲蕨科(Drynariaceae)槲蕨属的中型附生蕨类。

在我国主要分布于浙江、福建、台湾、广东、广西、江西、湖北、四川、贵州、云南等地。

槲蕨根状茎以骨碎补入药，作为骨碎补正品被收载于《中国药典》(周铜水和周荣汉，1998)。

槲蕨根状茎中主要活性成分(柚皮甙和总黄酮)含量高于其它同类植物(周铜水等，1997；周荣汉和段金廒，2005)，目前市售的骨碎补药材70％来源于槲蕨根状茎(周铜水和周荣汉,1998)，然而，传统的槲蕨药材完全来源于野生槲蕨的采挖，国内外人工繁殖和栽培槲蕨的工作仍处于起步阶段。

由于市场需求量大，导致野生槲蕨资源被过度开采，也严重破坏了槲蕨生存的生态环境。

2002年，槲蕨已被建议列入国家濒危保护植物名录(张宪春，2002)。

开展对槲蕨的人工繁育技术研究有助于促进槲蕨产业发展、保护槲蕨野生资源、缓解生态环境恶化。

[0004]目前已经通过诱导得到多种蕨类植物的GGB，但不同种类的GGB在大小、生长速率、外部形态方面存在一定差异，其适宜的增殖和分化条件也因种而异。

槲蕨人工繁育方面的工作已取得一些进展，专利《槲蕨的一种繁殖方法》(石雷和徐艳，2008)报道了将灭菌的槲蕨孢子播种在培养基上，获得无菌苗的方法，该方法可以快速获得槲蕨孢子体，但其受到孢子的活力限制，该方法仍然需要采集槲蕨的可育孢子叶、对收集的孢子进行妥善保存。

建立槲蕨种苗的GGB繁育途径可以打破该限制，但该方法至今尚未见报道。

另外，槲蕨组培苗需根状茎长约0.6～0.8cm时出瓶移栽，根状茎太小会导致操作费时，成活率低，目前尚未见促进瓶内槲蕨幼孢子体根状茎快速生长的技术。

发明内容
[0005]为解决上述问题，本发明提供一种绿色球状体(GGB)途径的槲蕨种苗组培快繁方法。

[0006]本发明的一种绿色球状体(GGB)途径的槲蕨种苗组培快繁方法包括如下步骤：外植体的消毒；GGB的诱导；GGB的增殖培养；GGB的分化培养；芽丛切分；幼孢子体培养。

[0007]本发明所用的外植体为生长健壮的槲蕨根状茎，优选生长季节当年生的根状茎。

[0008]本发明中槲蕨根状茎外植体消毒方法为：将根状茎置于浓度为5g/L的洗洁精溶液中浸泡5～10min，在流水下冲洗30～60min，待不产生泡沫后捞出用滤纸吸干表面水分，以75％酒精溶液浸泡30s，然后迅速放入0.1％升汞溶液中表面消毒6～8min，最后用无菌水冲洗3～5次。

[0009]本发明中槲蕨GGB的诱导方法为：将消毒后的根状茎切成0.5cm长的小段，接种诱导培养基中，置于培养室培养，诱导培养基以1/2MS为基本培养基，添加2.0mg/L 6-BA、30g/ L蔗糖、7g/L琼脂，在高温高压灭菌前将pH调至5.8～5.9。

本发明中外植体约在2个月左右产生明显的GGB；
[0010]本发明中槲蕨GGB的增殖培养方法为：将诱导得到的GGB转接于GGB增殖培养基中，置于培养室中避光培养，增殖培养基为1/2MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂；60～80天后需将GGB切分并重新接种于增殖培养基中，增殖培养时间过长GGB增殖速率降低，而分化率增加。

[0011]本发明中槲蕨GGB的分化培养和芽丛切分方法为：将处于增殖状态的GGB接种于分化培养基中，置于培养室中培养，分化培养基为1/2MS+3％蔗糖+0.7％琼脂。

待GGB分化产生大量丛生芽后，将丛生芽切分并继代接种于分化培养基中。

由于GGB长期处于增殖状态，首次分化产生的丛生芽体积小不易分离，还会发生少量增殖生长，需多次切分培养才可获得独立的幼孢子体。

[0012]本发明中槲蕨幼孢子体培养方法为：将得到的独立幼孢子体接种于MS+3％蔗糖+ 0.7％琼脂培养基中，20-40天后转接至含有6％～8％蔗糖的基本培养基中，置于培养室培养20-30天，然后将幼孢子体转接至MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，2个月后继代一次，4个月后幼孢子体根状茎长约0.6～0.8cm，此时的幼孢子体具备叶片和不定根，已达到可出瓶状态。

[0013]本发明中的培养条件为：培养室温度为24±1℃，光照强度为50～60μmoL/(m2·s)，光周期为14/10h，相对湿度为30％。

在GGB增殖培养中避光处理需在培养皿上覆盖锡箔纸或双层黑布。

[0014]本发明中从处于增殖状态的GGB分化产生丛生芽至经过3～4次的切分继代获得独立幼孢子体，约需80～120天，独立的幼孢子体发育为可出瓶状态的种苗约需150～170天。

本发明在获得槲蕨GGB后，在GGB的增殖培养中，通过降低细胞分裂素的使用，以及使用黑暗条件，明显改善了在光照条件下GGB因分化而造成的增殖效率降低，提高了GGB的增殖速度，又降低了光能的使用成本。

[0015]槲蕨是匍匐生长的，根状茎上有生长点、而且储存营养物质，出瓶苗没有叶片或根也能存活，但根状茎必不可少。

槲蕨GGB分化产生芽丛后，切分芽丛得到的幼嫩孢子体的根状茎极小，而培养根状茎使其达到可以出瓶的体积所需时间较长。

本发明通过在培养基中添加较高浓度的蔗糖处理幼孢子体，大大提高了后期根状茎的生长速度，进而缩短了种苗的繁殖周期。

具体实施方式
[0016]本发明的方法包括如下步骤：外植体的消毒；GGB的诱导；GGB的增殖培养；GGB的分化培养；芽丛切分；幼孢子体培养。

[0017](1)外植体的消毒：选择生长健壮的槲蕨根状茎为外植体，将根状茎置于浓度为5g/L的洗洁精溶液中浸泡5～10min，在流水下冲洗30～60min，待不产生泡沫后捞出用滤纸吸干表面水分，以75％酒精溶液浸泡30s，然后迅速放入0.1％升汞溶液中表面消毒6～8min，最后用无菌水冲洗3～5次。

[0018](2)GGB的诱导：以1/2MS+2.0mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂为诱导培养基，将消毒后的根状茎切成0.5cm长的小段，接种至诱导培养基中，置于培养室培养。

[0019](3)GGB的增殖培养：将诱导得到的GGB转接于增殖培养基中，置于培养室中避光培养，增殖培养基为1/2MS+1.0～2.0mg/L6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂。

[0020](4)GGB的分化培养和芽丛切分：将GGB接种于分化培养基中，置于培养室中培养，分化培养基为1/2MS+3％蔗糖+0.7％琼脂。

待GGB分化产生大量丛生芽后，将丛生芽反复切分并继代接种于分化培养基中。

[0021](5)幼孢子体培养：将得到的独立幼孢子体接种于MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，30天后转接至含有6％～8％蔗糖的基本培养基中，置于培养室培养20天，然后将幼孢子体转接至MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中继续培养。

[0022]培养室条件：温度24±1℃，光照强度50～60μmoL/(m2·s)，光周期14/10h，相对湿度30％。

在GGB增殖培养中避光处理需在培养皿上覆盖锡箔纸或双层黑布。

[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0024]实施例1
[0025](1)外植体的消毒：选择生长健壮的槲蕨根状茎为外植体，将根状茎置于浓度为5g/L的洗洁精溶液中浸泡8min，在流水下冲洗60min，捞出用滤纸吸干表面水分，以75％酒精溶液浸泡30s，然后迅速放入0.1％升汞溶液中表面消毒6min，最后用无菌水冲洗5次。

[0026](2)GGB的诱导：以1/2MS+2.0mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂为诱导培养基，将步骤(1)消毒后的根状茎切成0.5cm长的小段，接种至诱导培养基中，置于培养室培养，55d可见少量直径0.1～0.2cm的GGB，GGB诱导率35％。

[0027](3)GGB的增殖培养：将步骤(2)得到的GGB转接于GGB增殖培养基中，置于培养室中避光培养，避光条件为在培养皿上覆盖锡箔纸，增殖培养基为1/2MS+1.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂。

30天后GGB平均鲜重50.2mg，分化率约28％；60天后GGB平均鲜重81.3mg，分化率约为45％。

[0028](4)GGB的分化培养和芽丛切分：将步骤(3)增殖的GGB接种于分化培养基中，置于培养室中培养，分化培养基为1/2MS+3％蔗糖+0.7％琼脂。

30天后GGB分化产生大量丛生芽，此时丛生芽大小不一，将每个芽丛切分为4～5丛，继代于分化培养基中。

每隔30天再次切分并继代。

经过3次切分后获得独立幼孢子体。

[0029](5)幼孢子体培养：将步骤(4)得到的独立幼孢子体接种于MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，30天后转接至含有6％蔗糖的基本培养基中，置于培养室培养20天，然后将幼孢子体转接至MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，2个月后继代接种至相同培养基，4个月后幼孢子体平均鲜重0.64g，其中根状茎平均鲜重约0.35g。

[0030]实施例2
[0031](1)同实施例1步骤(1)。

[0032](2)同实施例1步骤(2)。

[0033](3)GGB的增殖培养：将步骤(2)得到的GGB转接于GGB增殖培养基中，置于培养室中避光培养，避光条件为在培养皿上覆盖双层黑布，增殖培养基为1/2MS+2.0mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂。

30天后GGB平均鲜重51.6mg，分化率约27％；60天后GGB平均鲜重88.4mg，分化率约为32％。

[0034](4)GGB的分化培养和芽丛切分：将步骤(3)增殖的GGB接种于分化培养基中，置于培养室中培养，分化培养基为1/2MS+3％蔗糖+0.7％琼脂。

30天后GGB分化产生大量丛生芽，此时丛生芽大小不一，将每个芽丛切分为4～5丛，继代于分化培养基中。

每隔30天再次切分并继代。

经过4次切分后获得独立幼孢子体。

[0035](5)幼孢子体培养：将步骤(4)得到的独立幼孢子体接种于MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，30天后转接至含有8％蔗糖的基本培养基中，置于培养室培养20天，然后将幼孢子体转接至MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，2个月后继代接种至相同培养基，4个月后幼孢子体平均鲜重0.77g，其中根状茎平均鲜重约0.42g。

[0036]对比例1
[0037](1)同实施例1步骤(1)。

[0038](2)同实施例1步骤(2)。

[0039](3)GGB的增殖培养：将步骤(2)得到的GGB转接于GGB增殖培养基中，置于培养室中光照培养，增殖培养基为1/2MS+1.5mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂。

30天后GGB平均鲜重58.2mg，分化率约78％；60天后GGB平均鲜重83.1mg，分化率为100％。

[0040](4)GGB的分化培养和芽丛切分：将步骤(3)增殖的GGB接种于分化培养基中，置于培养室中培养，分化培养基为1/2MS+3％蔗糖+0.7％琼脂。

30天后GGB分化产生大量丛生芽，此时丛生芽大小不一，将每个芽丛切分为4～5丛，继代于分化培养基中。

每隔30天再次切分并继代。

经过4次切分后获得独立幼孢子体，每次切分时均可得到幼孢子体，切分次数越多，得到的幼孢子体数量越多。

[0041](5)幼孢子体培养：将步骤(4)得到的独立幼孢子体接种于MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，30天后转接至MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，3个月后继代接种至相同培养基，4个月后幼孢子体平均鲜重0.49g，其中根状茎平均鲜重约0.24g。

[0042]对比例2
[0043](1)同实施例1步骤(1)。

[0044](2)同实施例1步骤(2)。

[0045](3)同实施例2步骤(3)。

[0046](4)同实施例2步骤(4)。

[0047](5)幼孢子体培养：将步骤(4)得到的独立幼孢子体接种于MS+3％蔗糖+0.7％琼脂培养基中，30天后将幼孢子体分别接种于含有3％、6％、9％蔗糖的MS+0.7％琼脂培养基中，置于培养室中培养，期间不继代，80天后使用分析天平秤量每种培养基中幼孢子体的鲜重，然后去除幼孢子体的叶片和根秤量根状茎的鲜重。

结果发现，含3％蔗糖的培养基中幼孢子体的平均鲜重为223.8mg，其中根状茎平均鲜重约72.8mg；含6％蔗糖的培养基中幼孢子体的平均鲜重为84.0mg，根状茎平均鲜重约30.3mg；含9％蔗糖的培养基中幼孢子体的平均鲜重为43.2mg，根状茎平均鲜重约19.2mg。

结果表明，长期在含有较高浓度蔗糖的培养基中，幼孢子体的生长受阻，根状茎生长缓慢。

[0048]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。