毒理基因组学与系统毒理学

（RNA依赖性RNA聚合酶）
（RNaseⅢ样特异核酸酶）
（RNA诱导的沉默复合体） （RNA依赖性RNA聚合酶）

RNAi作用机制示意图
RNAi基本实验步骤： （哺乳动物细胞为受试细胞） 1.确定待干扰(沉默)的目的基因(实际上是mRMA)； 2.设计相应的siRNA序列； 3.制备siRNA； 4.将siRNA转染细胞； 实际上siRNA的转染是将siRNA和siRNA表达载体（框架） 导入哺乳动物细胞，常用方法有：脂质体转染试剂法、电穿 孔法、病毒介导法。 5.RNAi效果评价（即基因沉默效果检测） 评价方法： ①mRNA水平检测-Northern blot 和 real time-RT-PCR； ②蛋白质水平检测-Western blot、荧光免疫法、流式细 胞术等。
SAGE方法： 通过对cDNA制备“SAGE标签”，并将这些标签串联起 来，然后对其进行测序，可以显示各SAGE所代表的基因在 特定组织中是否表达，还可根据其标签出现的频率来代表 基因表达的丰度。 主要用途： ①全基因组基因表达分析； ②寻找差异基因； ③发现新基因（或突变基因）。
（三）DNA微阵列分析 （DNA microarray assay）或DNA芯片（DNA chip） 基本硬件： 载有成千上万寡聚核苷酸片段或DNA探针（基因特异的 寡核苷酸、cDNA或EST）基因微阵列或基因芯片。 实验方法： 将动物或细胞染毒，细胞与毒物接触后基因活化或抑 制（mRNA转录改变），提取对照组和染毒组细胞总mRNA， 再分别用发绿色荧光的Cy5和红色荧光的Cy3荧光素标记各 自的mRNA，加入到基因芯片，由于荧光强度与RNAs含量有 一定相关关系，故可通过测定两种荧光的相对强度变化来 确定实验组样品中DNA表达的差异。 显色评价： 荧光红色---处理组样品某个基因RNA量＞对照组； 荧光绿色---处理组样品某个基因RNA量＜对照组； 黄色荧光---处理组样品某个基因RNA量＝对照组。
基因芯片照片
DNA微阵列监测流程图
微阵列芯片工作基本步骤
特点： 既有较高的敏感性（1-5个拷贝mRNA/细胞），也有较高的特异性，探针 仅对特定目标序列敏感，而对其他序列不产生杂交信号。
（四）RNA干扰技术 （RNA interference, RNAi） 基本概念： RNAi是指与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的 一种特异性基因沉默现象。 基因沉默的两种方式： 转录基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)，它包括RNAi、共抑制等。 干扰原理： RNAi是指将外源性双链RNA（dsRNA）导入细胞后， 在RNaseⅢ样特异核酸酶(Dicer)作用下切割加工成21~23nt长 度的小分子干扰RNA（siRNA），引起细胞内与其序列同源 的特异mRNA降解，干扰靶基因表达（即基因沉默）。
毒理基因组学（Toxicogenomics） 基本任务： 是利用人类基因组的资料，帮助筛选和鉴别潜在性的 环境遗传性毒物，并在基因水平上阐明毒作用发生机制。 研究目标： 近期目标-确定某种有害因素的反应基因（信号基因） 开展毒效应和相关疾病机制的研究。 远期目标-建立全基因组/蛋白质组毒性反应数据库， 开辟以芯片技术和生物信息技术为特征的数字毒理学研究 领域。
第十章
毒理基因组学与系统毒理学
Toxicogenomics and System Toxicology
概述 毒理基因组学研究技术平台 毒理基因组学研究内容及其应用 从毒理基因组学到系统毒理学
第一节 概述
毒理基因组学（toxicogenomics）：
是研究生物体整个基因组与环境有害因素（化学
第二节 毒理基因组学研究技术平台
毒理基因组学研究面临的基本挑战： 1.发展高通量筛选系统 如：DNA微阵列技术与芯片技术 2.大量生物学信息处理 如：DNA微阵列技术可测定上万个基因表达，获得约 30万个数据，这些数据如何处理分析，又如何结合传统毒 理学试验资料进行综合分析。
一、基因组学/转录组学技术平台 （一）差异显示反转录PCR技术（DDRT-PCR） 它是一种将mRNA反转录技术、PCR技术与聚丙酰胺凝胶 电泳相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。 基本原理： 以一对细胞（或组织）的总RNA反转录而成的cDNA为模 板，利用PCR高效扩增，通过5’端和3’端引物的合理设计 和组合，将细胞（或组织）中表达的约15000种基因片段直 接显示在DNA测序胶上，从而找出一对细胞（或组织）中表 达有差异的cDNA片段。 优点：周期短；功能多；灵敏度高；重现性好；所需 RNA量少（100个反应仅需1ugmRNA）等。 缺点：假阳性高；凝胶中单链cDNA带成分不均一；低 拷贝数mRNA不能有效出现等。
SNPs检测技术： 1.限制性酶切片段长度多态性（RFLP）检测技术 2.单链构象多态性（SSCP）检测技术 3.等位基因特异寡聚核苷酸杂交（ASO）等 这些方法由于必须通过凝胶电泳进行检测，很难实现 快速、高效、自动化目标，而DNA芯片技术可成为SNPs高通 量检测手段。 SNPs检测意义： 由于SNPs（称cSNPs）与蛋白质功能有关，因此SNPs对 探讨或评价化学毒物体内代谢差异以及毒性易感性具有重 要意义。 还可用于遗传流行病学“疾病-基因关联性研究”。
因素、物理因素、生物因素）间的交互作用及其方式 的一门新兴学科。 化学物质-毒物基因组学
人类基因组计划 （Human Genome Project, HGP） 1985年美国科学家率先提出，有美、英、德、日、法、 中等6个国家参与，经费预算30亿美元，对23对染色体上的 基因进行测序（大约需要破解4万个基因密码），2005年完成。 人类基因组含有约30亿个DNA碱基对，其中外显子占总 长度的1.5%。 现在：由人类基因组学发展到了“后基因组时代” 从结构基因组学过渡到了“功能基因组学” 基因组学→转录组学→蛋白质组学→代谢组学 （还包括遗传多态性等） 环境基因组计划-环境应激的基因多态性研究 （Environmental Genome Project, EGP ）
常见的蛋白质质谱检测技术: 1.多向蛋白质鉴定技术（MudPIT) 它是在多级LC/MS/MS的基础上发展起来的技术。首先 将蛋白质酶解→多肽混合物→进样到强阳离子交换色谱柱 →直接脱洗→进样到反相液相色谱柱上→梯度脱洗→分离 馏分用MS/MS鉴定。（适用于大规模蛋白质分离鉴定） 2.放射性核素亲和标签（ICAT）技术 用化学性质相同而质量不同的2种放射性核素分子对蛋 白样品的半胱氨酸进行标记，然后进行质谱分析。通过比 较质谱峰强弱对蛋白质定量比较。 3.分子扫描技术 将双向凝胶转到涂有酶解液的膜上，转膜同时进行酶 切，利用质谱扫描鉴定，它是2-DE与BMS相结合的方法。
（六）DNA深度测序 (DNA deep sequencing) 是指能够一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测 定，可对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌分析的 技术，又称“为下一代测序技术”。 根据测序平台不同，深度测序一次可以读取约40万至 400万条DNA序列，可读取长度从几十个、几百个或数千个 碱基数序列。 测序深度评价：
毒理基因组学检测技术发展： 传统遗传毒性检测方法→基因集群检测方法 例如：微阵列技术（或DNA基因芯片） 微阵列技术优势： ①扩大了遗传毒性损伤的检测范围；
即一个化学物多基因效应，或多个化学物多基因效应。
②增加了遗传毒性损伤的检测效率； ③提高了遗传毒性损伤的检测灵敏度。 （与Northen blotting分析相似） 该技术可以检测一种化学物对人类全部基因组的效 应，减少了遗传毒性传统检测方法的假阴性。 （传统检测方法：“一个化学物，一个基因”）
（二）生物质谱技术 （biological mass spectrometry，BMS） 基本原理： 是样品分子离子化后，根据不同离子间的质荷比的差异 来分离并确定相对分子质量。 生物质谱类型： ①基质辅助激光解吸离子质谱（MALDI） ②电喷雾离子化质谱（ESI） ③表面增强激光解吸离子-飞行时间质谱 （SELDI-TOF-MS） 优点：结合了芯片和质谱技术，有利于蛋白质高效、快 速和高通量检测，在数分钟内可同时分析上百种蛋白质。
毒理基因组学研究计划 （Toxicogenomics Research Project, TRP） 20世纪90年代后期提出。 最初概念： 是将基因组学的理论和技术应用于毒理学领域，研究 外源化学物对组织细胞特定基因功能的改变，并预测外源 化学物毒性的科学。 目前概念： 不仅包括在基因组水平的效应，也包括对RNA表达、 蛋白质表达、代谢谱改变以及遗传多态性（即包括后基因组 学）的影响。
（五）单核苷酸多态性（SNPs）监测 (single nucleotide polymorphism，SNP) 它是指在DNA基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起 的DNA序列多态性。在人群中其发生频率＞1%，90%以上的 DNA序列多态性具有可遗传性。 SNPs的单核苷酸变异类型： 转换—嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶的置换 颠换—嘌呤与嘧啶间的置换 插入—插入一个碱基（嘧啶或嘌呤） 缺失—丢掉一个碱基（嘧啶或嘌呤） SNPs特点： ①25%的SNPs发生在CpG位点，发生C→T转换； ②人类基因组单个碱基改变发生率约1‰； ③核苷酸变异呈不均匀性分布，在基因编码区估计 有约2×105个SNPs（称cSNPs），与蛋白质功能有关。
测序深度 测序获得的碱基总数 基因组大小
测序深度与基因组覆盖率呈正相关关系，测序带来的 假阳性率或错误率会随深度增加而降低。
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） 硫酸十二烷酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
对照组 组织细胞总RNA提取 mRNA完整性鉴定
处理组 组织细胞总RNA提取 mRNA完整性鉴定
设计3’-端锚定引物逆转录成cDNA 采用此引物和5’-端随机引物对cDNA进行选择性PCR扩增 扩增产物进行凝胶电泳分析 差异条带的回收，第二次PCR扩增 用Northern与Southern杂交，再次确定差异条带的真实性 差异条带的克隆、测序，与基因序列数据库的序列作同源比较分析 （联机检索） 以差异条带为探针从基因组DNA中筛选到全长 的DNA序列或基因组克隆
对照组对照组组织细胞总rna提取mrna完整性鉴定处理组处理组组织细胞总rna提取mrna完整性鉴定设计3端锚定引物逆转录成cdna采用此引物和5端随机引物对cdna进行选择性pcr扩增扩增产物进行凝胶电泳分析差异条带的回收第二次pcr扩增用northern与southern杂交再次确定差异条带的真实性差异条带的克隆测序与基因序列数据库的序列作同源比较分析与基因序列数据库的序列作同源比较分因表达序列分析serialanalysisgeneexpressionsage理论依据
（在预制IPG胶条上）
蛋白质等电聚焦电泳分离 将蛋白质转移到SDS-PAGE凝胶上电泳
（注：与第一向垂直分离）
质谱的多肽指纹图谱与微序列分析
双向凝胶电泳技术缺陷： （1）不能很好地显示低丰度蛋白、疏水性膜蛋白、极 酸或极碱性蛋白、极大或极小分子蛋白； （2）不同样品间难以进行定量比较； （3）费时、费力，不容易自动化检测； （4）重现性差等。 近年来出现了“胶上差示电泳”（DIGE）技术： 将不同样品蛋白质标上不同的荧光染料（如cy3），在 同一块胶上进行电泳分离，用荧光扫描仪进行识别。 技术优点： ①重现性好； ②灵敏度高； ③质谱兼容等。
（二）基因表达序列分析 （Serial Analysis of Gene Expression, SAGE ） 理论依据： 来自cDNA3’端特定位置的一段9～11bp长的DNA序列能 够区分基因组中95%的基因，这一段特异的基因序列被称为 标签（SAGEtag）. SAGE原理： 由一个9～11碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信 息，即一个标签能确认一种转录物。例如，一条9个碱基的 序列能够分辨262144个不同的转录物（49个），而人类基 因组估计仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9碱 基标签能够代表一种转录物的特征序列。 前提条件：GeneBank中有所测物种的DNA序列信息，尤 其是表达序列标签（EST）资料。
二、蛋白质组学技术平台 （一）双向凝胶电泳 （2-dimensional gel electrophoresis，2-DE） 基本原理： 细胞蛋白质样品在电泳过程中，由于蛋白质所带电荷 大小与分子量大小不同而被分离。 immobilized pH gradient（IPG） 实验步骤： 固相pH梯度 样品制备与处理