细胞凋亡
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细胞凋亡
医学病毒学研究所
刘媛媛
概念
细胞凋亡 (apoptosis ) 是在一定的生理或病理 条件下，一种由基因调控的细胞主动的死亡过程。 程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)，在一定时间内，细胞按一定的程序发生 死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选 择性。
细胞凋亡与PCD的区别
②分隔机制 在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等 的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并 脱落形成凋亡小体。
③自噬体形成机制 凋亡细胞内线粒体、内 质网等细胞器和其他胞质成分一起被内质网 膜包裹形成自噬体，自噬体在与凋亡细胞膜 融合后排出胞外形成凋亡小体。 有些细胞不形成若干个凋亡小体，而仅 仅发生核固缩和胞质浓缩，成为单个致密的 结构，这也被称为凋亡小体。在病毒性肝炎 中见到的嗜酸性小体就是凋亡小体的例子。
可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质 固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞 质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽” 及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞 噬现象。
2. 生化特征检测
1.细胞凋亡最显著的生化特征是ca2+、 Mg2+依赖的内源性核酸酶激活后，将细 胞核染色体从核小体间断裂，形成约为 180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸 片段。 2.针对此寡核苷酸片段发展了检测凋亡的 琼脂糖凝胶电泳法、原位末端标记法和 ELISA法等，这些方法具有很高的特异 性和敏感性，为凋亡的研究提供了强有 力的工具和手段。
细胞凋亡从启动到凋亡小体被吞噬最短的仅需 数分钟，而凋亡小体被吞噬细胞吞入后几小时 才被消化成残余体，因此实验中经常见到的是 凋亡小体被吞入后进行消化降胞内聚集的染色质块形成大 小不等的核碎片后，整个细胞通过发芽(by budding)、起泡(by zeiosis)等方式形成一个个球 形突起，并在根部缩窄脱落，形成一些大小不等、 内含胞质、细胞器以及核碎片的膜性小体，即凋亡 小体。
台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为 坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方 法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
HE染色:凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有
“出芽”现象。
甲基绿一派诺宁染色
细胞坏死的形态学特征
膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化， 内质网扩张，核染色质不规则位移，进而 线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破 裂，细胞质的内容物外溢，引起严重的炎 症反应。坏死的细胞常常是成群的细胞一 起丢失。
细胞凋亡与细胞坏死的形态学比较
凋亡的生化反应
主要是细胞核的DNA被核酸内切酶在核小 体单位之间降解，产生若干大小不一的寡 核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现 DNA“梯形带”，这些区带由180~200个碱 基对整数倍的寡核苷酸片段组成。
Giemsa染色
（2）荧光染料吖橙(AO)、Heochst33258染色，在荧光显微镜下观察。
活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质 呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
AO-EB染色法
hoechst33258染色，细胞核会呈 致密浓染，或呈碎块状致密浓染。
（3）制成超薄切片用电子显微镜观察。
细胞凋亡中染色体裂解为DNA片段
细胞凋亡往往需要新的基因转录和蛋白质 合成， 因而需要能量。但是，有些细胞发 生凋亡时，染色质DNA并不降解，表明 DNA降解并不是细胞凋亡必不可少的内 容。而细胞坏死时没有新的基因表达和蛋 白质合成，不需要能量，DNA被随机降 解为任意长度的片段，在电泳时显示连续 的“涂片带”。
(一)透射电镜观察
在透射电镜下发现凋亡细 胞核的变化发生较早，染 色质迅速浓缩，常形成致 密的新月形帽状结构，附 着于核膜下。附着区核孔 消失，核仁分解为许多嗜 锇酸的细小颗粒，分布于 核的中央。随后，核发生 碎裂。细胞表面的特殊结 构如微绒毛、细胞连接等 减少甚至完全消失。胞质 浓缩，但细胞器的结构仍 保留。线粒体和核糖体的 结构完整。
第二节 细胞凋亡的检测方法
1. 形态学检测 2. 生化检测 3. 流式细胞仪检测
1. 形态学检测
形态学检测是鉴定细胞凋亡最可靠的方法之一。主 要是通过光学显微镜和电子显微镜对组织或细胞进 行各种染色。 （1）台盼蓝染色、HE染色、甲基绿-派诺宁染色、 Giemsa染色、细胞骨架染色，在光学显微镜下观察。
原位末端标记测定法
凋亡细胞可产生大量180～200bp整倍数的寡核苷酸片断， 脱氧核糖核酸末端转移酶(TDT)能将外源性的生物素标记 的dUTP连接到DNA断链(双链或单链)的3-羟基(3-OH)末 端。由于生物素可与连接了过氧化物酶(POD)的亲和素 (streptavidin)特异结合，在POD底物二氨基联苯胺(DAB) 存在下，可产生很强的颜色反应，从而使凋亡细胞被检测 出来，这种方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺 口末端标记法(TUNEL) 该法可对完整的凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色， 能准确反映凋亡细胞典型的生化特征，灵敏度高，在普 通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。
细胞凋亡过少也可引起疾病发生： 在肿瘤的发生过程中，诱导凋亡的基因如 p53等失活、突变，而抑制凋亡的基因如 bCL-2等过度表达，都会引起细胞凋亡显 著减少，在肿瘤发病学中具有重要意义； 针对自身抗原的淋巴细胞的凋亡障碍可导 致自身免疫性疾病（SLE）；某些病毒能 抑制其感染细胞的凋亡而使病毒存活。
细胞死亡结局
近年来有人认为，凋亡与坏死没有绝对的区别 界限，在一定的条件下凋亡可以转化为坏死。 在体外诱导凋亡的实验中发现，适量的诱导剂 可以诱导出细胞凋亡，继续增加诱导剂的用量 则诱导出坏死的改变。
在体内，如果凋亡小体不被识别，吞噬功能障 碍，不能及时清除凋亡小体，凋亡小体的完整 膜结构破坏后，内含的溶酶体释出，可引起组 织坏死。
第一节
细胞凋亡的形态学特征
一、光镜下的形态学特征
凋亡细胞在 光镜下的形态 学特征表现为 核固缩、胞质 浓缩、细胞体 积急剧变小。 其中胞核变化 最为显著。
凋亡细胞：凋亡细胞与邻近细胞分离
二、细胞凋亡在电镜下的形态学特征
在光学显微镜下用常规方法判断细 胞凋亡比较困难，而超微结构观察 则可显示凋亡细胞的许多特征。到 目前为止，超微结构改变仍为确定 细胞凋亡发生的最可靠的方法之一。
核小体上的DNA双链长度为140bp，核小体之间是 长度为50~60bp的DNA链和组蛋白H1组成的连接区。 核小体和连接区组成核心核小体亚单位，总长度为 180~200bp。 在凋亡时核酸内切酶活化，在连接区特异性切断 DNA链，因此形成的DNA片段的长度总是核心核小 体亚单位DNA长度， 180~200bp整倍数，这个长度 即是核小体重复单位的大小。
线粒体功能检测
其检测主要采用阳离子型荧光染料（ApoAlert试剂盒 ）。原理是：正常细胞中， 染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红 色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位 发生改变，染料无法进入线粒体，只能在 胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。 可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用 488nm激发，其检测波长分别是527nm 和590nm。
内质网明显扩张，扩张的内质网与细胞膜融合，在融合 处的细胞膜有火山口样的凹陷形成，有的形成大囊泡， 成为特征性的发泡现象。 同时质膜也明显卷曲、内折，包绕胞质成分和浓缩、碎 裂的核碎片，使整个细胞崩解成为一系列大小不等的有 质膜围绕的致密的凋亡小体。 少数凋亡小体有核物质，而其他凋亡小体只含有胞质的 成分。组织内凋亡小体形成后很快被附近的细胞识别、 吞噬和消化。
1. PCD侧重于功能方面，凋亡则是形态学方 面的含义，通常人们未加以严格区分而等 同使用 2. 有些PCD不表现为细胞凋亡的形态学和生 化特征，被称为非凋亡的程序性细胞死亡 3. 细胞凋亡也可见于PCD之外的病理状态， 如抗癌药所致的癌细胞死亡、循环负荷过 重引起的心肌细胞死亡等
细胞凋亡的生物学意义
(二)扫描电镜观察
在扫描电镜下，凋亡细胞显示细胞体积缩小，微绒毛减少或消 失。部分细胞表面出现单个或多个泡状突起，常位于细胞的一 侧，且大小不等，有的球形小体与胞体间连接变窄。用蚀刻法 显示核孔分布异常，其全部移到染色质疏松部位，染色质浓缩 部位核孔消失。
超微结构的变化
可分为2个阶段
第1阶段为细胞核固缩、细胞质浓缩及凋亡小体 形成； 第2阶段是凋亡小体被其他细胞吞噬和降解。
四、细胞凋亡与细胞坏死
细胞凋亡和细胞坏死是多细胞生物中细胞死亡 的两种不同形式，它们在多方面有着本质的区 别： 形态学 分子机制 生物学意义
凋亡细胞的形态学特征
细胞体积缩小，核染色质浓缩、凝集，常 呈新月形，胞浆浓缩，线粒体无大变化， 内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，细胞 膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜 性结构、内含各种细胞成分的凋亡小体。 由于凋亡小体具有完整的膜结构，不出现 溶酶体酶等细胞内涵物外泄，故不引起炎 症反应和次级损伤。 ·
•在发育过程中清除多余的细胞 •清除已完成功能的细胞 •清除发育不正常的细胞 •清除正常生理活动过程中无用的细胞 •清除病理活动中有潜在危险的细胞
细胞凋亡的失常所导致疾病
细胞凋亡过多可引起疾病发生： ①爱滋病的发展过程中，CD4+T细胞数目的减 少； ②移植排斥反应中，细胞毒性T细胞介导的细胞 死亡； ③缺血及再灌注损伤，导致心肌细胞和神经细胞 的凋亡增多； ④神经系统退化性疾病（Alzheimer病、 Parkinson‘s病）的重要原因是细胞凋亡的异常 增加。神经细胞的凋亡参与老化及Alzheimer病 的发生。 ⑤暴露于电离辐射可引起多种组织细胞的凋亡。
AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测
PI和Annexin-V双标： 磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内 侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时） PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面， 暴露在细胞外环境中。 Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨 酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡 或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的 坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的 细胞PI是阳性
4. 彗星电泳法
将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶电泳中，裂 解处理后电泳，用荧光染料染色，凋亡细 胞细胞核出现彗星状图案。
3. 流式细胞仪检测
用流式细胞仪检测细胞凋亡有其他方法不可比 拟的优越性，既可定性又可以定量，且具有简单、 快速和敏感性高等优点，通过流式细胞仪，还可 以将细胞分类后作进一步的形态学和生化分析。
上图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的 检测结果，横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐标是PI，左上、右上、左下、右下四 个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下 象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细 胞。
DNA周期检测
利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞 各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同， 流式检测的荧光轻度也不一样。G2－M期DNA含量是G0 －G1的两倍，而S期介于两者之间。 但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞 G0－G1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。 但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的，因而非 常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风 靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。 下图横轴代表PI的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期 根据荧光强度可以简单的进行区分。
凋亡细胞DNA的电泳图
坏死与凋亡的区别
细胞坏死 细胞死亡原因 外界伤害所致 的被动死亡
细胞凋亡 生理病理条件下由基因控 制的
细胞死亡过程
膜通透性增高、 质膜整合性好、核凝集、 出现凋亡小体 细胞溶解、早 期核无变化 引起严重的炎 症反应。成群 细胞丢失、瘢 痕形成。 不伴有炎症反应、单个细 胞丢失、不形成瘢痕
流式细胞仪检测凋亡的原理主要是根据凋亡 引发的在细胞、亚细胞和分子水平所发生的特征 性改变(包括细胞膜、细胞器和细胞核等的改变)， 造成染色体荧光染料对凋亡细胞DNA的可染性 发生改变，以及细胞形态的改变影响了光散射特 性。
流式细胞仪在细胞凋亡中的应用
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的 流式细胞仪的检测方法，可以采用以下检 测方法： 1、线粒体功能 2、DNA Cycle 3、Caspases 4、Annexin V Assay 5、DNA Fragmentation Assays
医学病毒学研究所
刘媛媛
概念
细胞凋亡 (apoptosis ) 是在一定的生理或病理 条件下，一种由基因调控的细胞主动的死亡过程。 程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)，在一定时间内，细胞按一定的程序发生 死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选 择性。
细胞凋亡与PCD的区别
②分隔机制 在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等 的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并 脱落形成凋亡小体。
③自噬体形成机制 凋亡细胞内线粒体、内 质网等细胞器和其他胞质成分一起被内质网 膜包裹形成自噬体，自噬体在与凋亡细胞膜 融合后排出胞外形成凋亡小体。 有些细胞不形成若干个凋亡小体，而仅 仅发生核固缩和胞质浓缩，成为单个致密的 结构，这也被称为凋亡小体。在病毒性肝炎 中见到的嗜酸性小体就是凋亡小体的例子。
可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质 固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞 质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽” 及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞 噬现象。
2. 生化特征检测
1.细胞凋亡最显著的生化特征是ca2+、 Mg2+依赖的内源性核酸酶激活后，将细 胞核染色体从核小体间断裂，形成约为 180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸 片段。 2.针对此寡核苷酸片段发展了检测凋亡的 琼脂糖凝胶电泳法、原位末端标记法和 ELISA法等，这些方法具有很高的特异 性和敏感性，为凋亡的研究提供了强有 力的工具和手段。
细胞凋亡从启动到凋亡小体被吞噬最短的仅需 数分钟，而凋亡小体被吞噬细胞吞入后几小时 才被消化成残余体，因此实验中经常见到的是 凋亡小体被吞入后进行消化降胞内聚集的染色质块形成大 小不等的核碎片后，整个细胞通过发芽(by budding)、起泡(by zeiosis)等方式形成一个个球 形突起，并在根部缩窄脱落，形成一些大小不等、 内含胞质、细胞器以及核碎片的膜性小体，即凋亡 小体。
台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为 坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方 法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
HE染色:凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有
“出芽”现象。
甲基绿一派诺宁染色
细胞坏死的形态学特征
膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化， 内质网扩张，核染色质不规则位移，进而 线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破 裂，细胞质的内容物外溢，引起严重的炎 症反应。坏死的细胞常常是成群的细胞一 起丢失。
细胞凋亡与细胞坏死的形态学比较
凋亡的生化反应
主要是细胞核的DNA被核酸内切酶在核小 体单位之间降解，产生若干大小不一的寡 核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现 DNA“梯形带”，这些区带由180~200个碱 基对整数倍的寡核苷酸片段组成。
Giemsa染色
（2）荧光染料吖橙(AO)、Heochst33258染色，在荧光显微镜下观察。
活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质 呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
AO-EB染色法
hoechst33258染色，细胞核会呈 致密浓染，或呈碎块状致密浓染。
（3）制成超薄切片用电子显微镜观察。
细胞凋亡中染色体裂解为DNA片段
细胞凋亡往往需要新的基因转录和蛋白质 合成， 因而需要能量。但是，有些细胞发 生凋亡时，染色质DNA并不降解，表明 DNA降解并不是细胞凋亡必不可少的内 容。而细胞坏死时没有新的基因表达和蛋 白质合成，不需要能量，DNA被随机降 解为任意长度的片段，在电泳时显示连续 的“涂片带”。
(一)透射电镜观察
在透射电镜下发现凋亡细 胞核的变化发生较早，染 色质迅速浓缩，常形成致 密的新月形帽状结构，附 着于核膜下。附着区核孔 消失，核仁分解为许多嗜 锇酸的细小颗粒，分布于 核的中央。随后，核发生 碎裂。细胞表面的特殊结 构如微绒毛、细胞连接等 减少甚至完全消失。胞质 浓缩，但细胞器的结构仍 保留。线粒体和核糖体的 结构完整。
第二节 细胞凋亡的检测方法
1. 形态学检测 2. 生化检测 3. 流式细胞仪检测
1. 形态学检测
形态学检测是鉴定细胞凋亡最可靠的方法之一。主 要是通过光学显微镜和电子显微镜对组织或细胞进 行各种染色。 （1）台盼蓝染色、HE染色、甲基绿-派诺宁染色、 Giemsa染色、细胞骨架染色，在光学显微镜下观察。
原位末端标记测定法
凋亡细胞可产生大量180～200bp整倍数的寡核苷酸片断， 脱氧核糖核酸末端转移酶(TDT)能将外源性的生物素标记 的dUTP连接到DNA断链(双链或单链)的3-羟基(3-OH)末 端。由于生物素可与连接了过氧化物酶(POD)的亲和素 (streptavidin)特异结合，在POD底物二氨基联苯胺(DAB) 存在下，可产生很强的颜色反应，从而使凋亡细胞被检测 出来，这种方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺 口末端标记法(TUNEL) 该法可对完整的凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色， 能准确反映凋亡细胞典型的生化特征，灵敏度高，在普 通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。
细胞凋亡过少也可引起疾病发生： 在肿瘤的发生过程中，诱导凋亡的基因如 p53等失活、突变，而抑制凋亡的基因如 bCL-2等过度表达，都会引起细胞凋亡显 著减少，在肿瘤发病学中具有重要意义； 针对自身抗原的淋巴细胞的凋亡障碍可导 致自身免疫性疾病（SLE）；某些病毒能 抑制其感染细胞的凋亡而使病毒存活。
细胞死亡结局
近年来有人认为，凋亡与坏死没有绝对的区别 界限，在一定的条件下凋亡可以转化为坏死。 在体外诱导凋亡的实验中发现，适量的诱导剂 可以诱导出细胞凋亡，继续增加诱导剂的用量 则诱导出坏死的改变。
在体内，如果凋亡小体不被识别，吞噬功能障 碍，不能及时清除凋亡小体，凋亡小体的完整 膜结构破坏后，内含的溶酶体释出，可引起组 织坏死。
第一节
细胞凋亡的形态学特征
一、光镜下的形态学特征
凋亡细胞在 光镜下的形态 学特征表现为 核固缩、胞质 浓缩、细胞体 积急剧变小。 其中胞核变化 最为显著。
凋亡细胞：凋亡细胞与邻近细胞分离
二、细胞凋亡在电镜下的形态学特征
在光学显微镜下用常规方法判断细 胞凋亡比较困难，而超微结构观察 则可显示凋亡细胞的许多特征。到 目前为止，超微结构改变仍为确定 细胞凋亡发生的最可靠的方法之一。
核小体上的DNA双链长度为140bp，核小体之间是 长度为50~60bp的DNA链和组蛋白H1组成的连接区。 核小体和连接区组成核心核小体亚单位，总长度为 180~200bp。 在凋亡时核酸内切酶活化，在连接区特异性切断 DNA链，因此形成的DNA片段的长度总是核心核小 体亚单位DNA长度， 180~200bp整倍数，这个长度 即是核小体重复单位的大小。
线粒体功能检测
其检测主要采用阳离子型荧光染料（ApoAlert试剂盒 ）。原理是：正常细胞中， 染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红 色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位 发生改变，染料无法进入线粒体，只能在 胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。 可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用 488nm激发，其检测波长分别是527nm 和590nm。
内质网明显扩张，扩张的内质网与细胞膜融合，在融合 处的细胞膜有火山口样的凹陷形成，有的形成大囊泡， 成为特征性的发泡现象。 同时质膜也明显卷曲、内折，包绕胞质成分和浓缩、碎 裂的核碎片，使整个细胞崩解成为一系列大小不等的有 质膜围绕的致密的凋亡小体。 少数凋亡小体有核物质，而其他凋亡小体只含有胞质的 成分。组织内凋亡小体形成后很快被附近的细胞识别、 吞噬和消化。
1. PCD侧重于功能方面，凋亡则是形态学方 面的含义，通常人们未加以严格区分而等 同使用 2. 有些PCD不表现为细胞凋亡的形态学和生 化特征，被称为非凋亡的程序性细胞死亡 3. 细胞凋亡也可见于PCD之外的病理状态， 如抗癌药所致的癌细胞死亡、循环负荷过 重引起的心肌细胞死亡等
细胞凋亡的生物学意义
(二)扫描电镜观察
在扫描电镜下，凋亡细胞显示细胞体积缩小，微绒毛减少或消 失。部分细胞表面出现单个或多个泡状突起，常位于细胞的一 侧，且大小不等，有的球形小体与胞体间连接变窄。用蚀刻法 显示核孔分布异常，其全部移到染色质疏松部位，染色质浓缩 部位核孔消失。
超微结构的变化
可分为2个阶段
第1阶段为细胞核固缩、细胞质浓缩及凋亡小体 形成； 第2阶段是凋亡小体被其他细胞吞噬和降解。
四、细胞凋亡与细胞坏死
细胞凋亡和细胞坏死是多细胞生物中细胞死亡 的两种不同形式，它们在多方面有着本质的区 别： 形态学 分子机制 生物学意义
凋亡细胞的形态学特征
细胞体积缩小，核染色质浓缩、凝集，常 呈新月形，胞浆浓缩，线粒体无大变化， 内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，细胞 膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜 性结构、内含各种细胞成分的凋亡小体。 由于凋亡小体具有完整的膜结构，不出现 溶酶体酶等细胞内涵物外泄，故不引起炎 症反应和次级损伤。 ·
•在发育过程中清除多余的细胞 •清除已完成功能的细胞 •清除发育不正常的细胞 •清除正常生理活动过程中无用的细胞 •清除病理活动中有潜在危险的细胞
细胞凋亡的失常所导致疾病
细胞凋亡过多可引起疾病发生： ①爱滋病的发展过程中，CD4+T细胞数目的减 少； ②移植排斥反应中，细胞毒性T细胞介导的细胞 死亡； ③缺血及再灌注损伤，导致心肌细胞和神经细胞 的凋亡增多； ④神经系统退化性疾病（Alzheimer病、 Parkinson‘s病）的重要原因是细胞凋亡的异常 增加。神经细胞的凋亡参与老化及Alzheimer病 的发生。 ⑤暴露于电离辐射可引起多种组织细胞的凋亡。
AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测
PI和Annexin-V双标： 磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内 侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时） PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面， 暴露在细胞外环境中。 Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨 酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡 或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的 坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的 细胞PI是阳性
4. 彗星电泳法
将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶电泳中，裂 解处理后电泳，用荧光染料染色，凋亡细 胞细胞核出现彗星状图案。
3. 流式细胞仪检测
用流式细胞仪检测细胞凋亡有其他方法不可比 拟的优越性，既可定性又可以定量，且具有简单、 快速和敏感性高等优点，通过流式细胞仪，还可 以将细胞分类后作进一步的形态学和生化分析。
上图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的 检测结果，横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐标是PI，左上、右上、左下、右下四 个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下 象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细 胞。
DNA周期检测
利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞 各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同， 流式检测的荧光轻度也不一样。G2－M期DNA含量是G0 －G1的两倍，而S期介于两者之间。 但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞 G0－G1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。 但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的，因而非 常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风 靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。 下图横轴代表PI的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期 根据荧光强度可以简单的进行区分。
凋亡细胞DNA的电泳图
坏死与凋亡的区别
细胞坏死 细胞死亡原因 外界伤害所致 的被动死亡
细胞凋亡 生理病理条件下由基因控 制的
细胞死亡过程
膜通透性增高、 质膜整合性好、核凝集、 出现凋亡小体 细胞溶解、早 期核无变化 引起严重的炎 症反应。成群 细胞丢失、瘢 痕形成。 不伴有炎症反应、单个细 胞丢失、不形成瘢痕
流式细胞仪检测凋亡的原理主要是根据凋亡 引发的在细胞、亚细胞和分子水平所发生的特征 性改变(包括细胞膜、细胞器和细胞核等的改变)， 造成染色体荧光染料对凋亡细胞DNA的可染性 发生改变，以及细胞形态的改变影响了光散射特 性。
流式细胞仪在细胞凋亡中的应用
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的 流式细胞仪的检测方法，可以采用以下检 测方法： 1、线粒体功能 2、DNA Cycle 3、Caspases 4、Annexin V Assay 5、DNA Fragmentation Assays