高致病性禽流感红细胞凝集(HA)与凝集抑制(HI)

高致病性禽流感红细胞凝集(HA)与凝集抑制(HI)试验
1.原理：禽流感病毒具有凝集鸡的红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(Hl)试验，具有特异性。

通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

2.用途：用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定和抗体检测。

3.试剂：禽流感病毒标准抗原、禽流感标准阴、阳性血清、阿氏液、1%的鸡红细胞、pH7.2的磷酸盐缓冲液。

4.设备耗材：普通天平、分析天平、普通离心机、微量振荡器、微量移液器、高压灭菌器、微量移液器、V形血凝反应板、吸头等。

5.操作步骤
6.1血凝试验：
5.L1取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔〜12孔每孔加25μLPBS;
5.L2吸取25μL病毒悬液加入第1孔中，吹打3〜5次充分混匀；
5.L3从第1孔中吸取25uL混匀后的病毒液到第2孔，混匀后吸取251IL加入到第3孔，依次进行倍比稀释至第11孔，最后从第11孔吸取25UL弃之，设定第12孔位PBS对照；每孔再加入25μLPBSo
5.1.4每孔加入25μLl%的鸡红细胞悬液（用前将鸡红细胞悬液充分混匀）；振荡混匀反应混合液，室温（20-25。

C）静置40min后观察结果。

5.L5结果判定：在PBS对照出现正确结果的情况下，将反应板
倾斜，观察红细胞是否完全凝集，以完全凝集的病毒最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度。

完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。

5.2血凝抑制试验：
1.1.11配制4单位抗原：根据血凝试验结果配制4单位抗原，以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4血凝单位抗原即为最高稀释倍数除以4。

加入抗原的血凝滴度为1:256,则4HAU抗原的稀释倍数为1:64,即ImI抗原加入到63mlPBS中即为4HAU 抗原；
1.1.2取96孔V形微量反应板，用移液器在第1〜11孔各加入25ULPBS,第12孔加入50ULPBS；
1.1.3第1孔加入25UL新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出25μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μL,第11孔做阴性对照，第12孔为PBS对照。

1.1.4在第1〜11孔各加入25μL4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物充分混匀，室温下（20〜25℃）静置30min;每孔加入25UL1%的红细胞悬液，轻晃混匀后，室温（20〜25℃）静置40min,当PBS对照红细胞呈明显纽扣状沉到孔底判定结果；
1.1.5结果判定：
1.对照孔红细胞呈明显的纽扣状沉到孔底，将反应板倾斜,红细胞星泪滴状流淌，试验成立。

2.完全凝集（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）o
3.根据血凝试验结果配制4HAU的抗原。

以完全凝集的病毒最高
稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。

导出公式：4HAU的抗原稀释倍数二血凝滴度/4。

备注：为防止4单位抗原配制不准确，可作回归试验检测：在微量反应板的1-4孔均加入O.025mLPBS.取4HAU混匀的抗原液0.025m 加入第1孔内，混匀后吸取0.025mL加入第2孔，依次倍比稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025mL弃之。

每孔均加入0.025mLl%鸡红细胞
悬液，轻轻混匀，37。

C下静止20分钟后观察结果。

若有2孔凝集，
则视为抗原配制正确。

6.溶液配制
6.1.1阿氏液配制：葡糖糖2.05g；柠檬酸钠0.8g；柠檬酸0.055g；氯化钠0.42g；加蒸僭水至IOomL；散热溶解后调PH值至6.1,69kpal5min高压灭菌，4℃保存备用。

6.1.2pH
7.20.OlmmolPBS配制：
氯化钠8.5g；磷酸氢二钾0.68g；氢氧化钠0.15g,加蒸储水至IooOmL,调PH值至7.2,69kpal5min高压灭菌，4。

C保存备用。

6.21%鸡红细胞悬液的配制：
采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的
血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2,0.0InImOI的
PBS液洗涤三次，每次均以IoOOrPm离心Iomin,洗涤后用
PBS配成体积分数为1%鸡红细胞悬液，4℃保存备用。