细胞计数与细胞增
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细胞污染
细菌污染 真菌污染 细菌和真菌的清除 支原体污染 支原体的清除
细菌污染
细胞培养常见的污染 最常见的有革兰氏阳性菌,如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰
氏阴性菌,其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改变。 污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡。
⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时,加液量不要溢出盖 片,也不要过少或带气泡。
⑥在计数过程中,对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下,数左 不数右的原则进行计数。
⑦染色标本在计数细胞时必须在15分钟内检查计数完毕。因为台盼蓝染液可 以将死细胞迅速地染上蓝色,再延长时间则活细胞也将逐渐着色。
细胞增殖实验(MTT法)
④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数, 计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞, 活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。另外,活力 测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液 对原细胞悬液的加倍稀释作用。
细胞计数时的注意事项
①消化单层细胞时,务求细胞分散良好,制成单个细胞悬液。否则 会影响细胞计数结果。
过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用,可达到更好的效果。 对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等,氨基糖苷
类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用。必要时更换所有培养用物。 通常,滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。 药物辅助高温处理法 • 先用药物处理后,再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀 死支原体,但对细胞有不良影响。 支原体特异性血清法 • 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原 体生长,故经抗血清处理后11天即转为阴性,并且5个月后仍为阴性。
危害:
世界性问题,平均发生率达到11% 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小,不易引起注意污染 来源: •操作环境不良 •操作人员的疏失 •实验器具不洁等 •已受污染的细胞 •已受污染的培养基、血清
支原体污染检测
荧光染色法 电镜检查:扫描电镜、透射电镜 支原体培养 聚合酶链反应(PCR)法
类型 细胞在体内、外的粘附方式:存在差异 体内:粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 体外:多数情况,细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态,可分为几大类型
分类 根据形态大致的不同,主要2类: 上皮样 成纤维细胞样 其它,不定型
上皮样细胞型
名称:仅形态上似体内,实际上不完全等于-来源:来源于外胚层,内胚层细胞
pH Hela
太酸或太碱
标准pH
成纤维细胞样 上皮样细胞
细胞密度 3T3 低密度
成纤维细胞样
高密度
上皮样细胞
生长状态改变 悬浮或贴附
转化与否
悬浮
圆形
未转化
贴附
成纤维或上皮样
转化后
成纤维样
可成上皮样
悬浮生长型
概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长
来源自血,脾或骨髓, 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能
二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定
在细胞生物学的实验中,往往要进行活细胞 的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度,是 进行实验必不可少的一种基本技能。
1.细胞计数
①将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上。 ②将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片
和计数板之间。 ③静置3分钟。 ④镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左
应用举例
1. MTT实验 6孔板接种HCCLM3细胞,1*106每孔,后取1*107病毒每孔加入
(LASS2与GFP对照),感染90分钟后,再加入1ml的培养液,24h后, 细胞用胰酶消化成细胞悬液,细胞调密度至1000每孔接种96孔平底板, 每孔100 ul(边缘孔用无菌PBS填充)。
5%CO2,37℃孵育24h后,每孔加入20ulMTT(噻唑兰)溶液 (5mg/ml),继续培养4h。终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入 150ul二甲基亚砜,37℃孵育15min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检 测仪490nm处测量各孔的吸光值。细胞分为3组:LASS2组,GFP组和 不加病毒对照组,每组3个复孔,同时设置调零孔(培养基、MTT、二 甲基亚砜)。连续检测6天,OD值绘生长曲线。
侧和上方的。然后按下式计算: 细胞数/ml=(4大格细胞总数/ 4)×10000 注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细
胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备 细胞悬液。
2.细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液,染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。
联合用药比单独用药效果好。 预防用药比污染后再用药效果好,一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量5~10倍药物冲洗
法,于加药后作用24~48小时,再换常规培养液。此 法在污染早期有效。
支原体污染
95%以上是以下四种支原体:
•口腔支原体(M.orale) •精氨酸支原体(M.arginini) •猪鼻支原体(M.hyorhinis) •牛莱氏无胆甾原体(idlawii)
细胞计数与细胞 增殖
金洁
一、培养细胞的形态观察
体外培养的细胞主要有两种状态。一 种是能 贴附在培养支持物上的细胞,如 HeLa 细胞、 NH3T3等,叫贴壁型细胞,体外培养的细胞 绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不 贴附在容器的壁上,而是悬浮在培养液中生 长,如 HL—60,叫做悬浮型细胞,这类细胞 主要是血液原性或癌原性的细胞。
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真菌污染
真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作 用而使细胞脱落死亡。
细菌和真菌的清除
使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。(当在无血清培养基中添 加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度 的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血 清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到 毒性水平)。
CCK-8方法
CCK-8是一种基于WST-8的检测细胞增殖和细胞毒性的方法。 WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的 情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的 formazan。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大, 细胞越少,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细 胞数目呈线性关系。 通常96孔板每孔加入10%培养基体积的CCK-8,在细胞培养 箱中继续孵育0.5-4个小时,时间的长短根据细胞的类型和细 胞的密度等实验情况而定,初次实验时可以在0.5、1、2和4 小时后分别用酶标仪检测,检测波长为450nm。
如:皮肤及其衍生物 消化道,乳腺,肺泡 上皮性肿瘤
形态:类似体内的上皮细胞 扁平,不规则多角形,中有圆形核
生长特点 易相连成片 相靠—紧密相连—成薄层—铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动
成纤维细胞样细胞
名称:凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源:由中胚层间充质组织起源的组织
如:真正的成纤维细胞 心肌,平滑肌,成骨细胞,血管内皮
②取样计数前,应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意 这一点。否则,前后计数结果会有很大误差。
③镜下计数时,遇见2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计数。 如细胞团占10%以上,说明消化不充分。
④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时,说明稀释不当, 需重新制备细胞悬液。
形态:似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
生长特点 排列成放射状,漩涡状 并不紧靠连成片, 细胞—细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞, 常有几个伸长的细胞突起
培养细胞形态不稳定
血清 Hela
高血清
低血清
成纤维细胞样 上皮样细胞
贴壁(粘附)型细胞
粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式
基于粘附特性,使细胞与细胞之间相互结合形成组织, 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。
培养时:这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某 一固相表面才能生存和生长,因而 属于粘附型细胞。
粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞:唯有粘附于固相表面才能 生存的细胞
C的作用下tetrazolium四唑环开裂,生成蓝色的结晶,结晶
的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消 失,不能将MTT还原)。还原生成的结晶可以用DMSO来溶 解,利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值,以反映出活 细胞数目。
(二)操作(实用于贴壁细胞) 1.接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔
1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul. 2.:培养细胞:同一般培养条件,培养2-3天(可根据试验目的和要求决
定培养时间)。 3.显色:分别培养不同时间,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.
继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞 需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟, 使结晶物充分融解。
4.比色:选择570nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记 录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
(三)结果
以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生 长曲线或计算细胞生长抑制率、细胞相对增 殖率等。
【注意事项】 1.选择适当得细胞接种浓度。边缘孔用无菌PBS填充。
特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形,单个或小细胞团
优点 生存空间大,提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态
缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
细胞形态观察
贴壁细胞在生长状态良好时,细胞内颗粒少,看不到有空泡, 细胞边缘清楚,培养基内看不到悬浮的细胞和碎片,培养液 清澈透明,而当细胞内颗粒较多,透明差,空泡多时,表明 生长较差。当瓶内培养基混浊时,应想到细菌真菌污染的可 能。悬浮细胞当边缘清楚,透明发亮时,生长较好;反之, 则较差或已死亡。由于培养基内有 pH 指示剂的存在,因此 它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时, 细胞一般生长状态较好;呈淡黄色时,则可能是培养时问过 长,营养不足,死亡细胞过多;如呈紫红色,则可能是细胞 生长状态பைடு நூலகம்好,或已死亡。
2.避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在显 色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3.设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验 步骤保持一致,最后比色以空白调零。每组设定3复孔。 4.MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。MTT一般 最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存 在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、 锡箔纸包住避光以免分解。 5.酶联免疫检测仪使用前应打开电源预热半小时。 6.选择不同的波长,酶联免疫检测仪检测灵敏度不同。应根据实验目的 选择相应的波长。 7.悬浮细胞先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟。或用cck-8。
支原体污染表现
细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓,部分细胞发 生脱落等等,细胞间隙可见铺满细沙样小点。
荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体
荧光染色法(33258)显示染色体,细胞周围亮点为支原体
扫描电镜法显示支原体,附于细胞表面众多的圆 形颗粒为支原体
支原体的清除
支原体清除剂MRA (Mycoplasma Removal Agent)处理法 • 每4天换一次液,连续处理15天 清洗纯化法 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 原理:由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通
(一)原理
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT(噻唑蓝)为 基础。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作 用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素