WesternBlot常见问题及处理总结

WesternBlot常见问题及处理总结
免疫细胞研究wesｔｅrn blot
Ｗestｅｒn Blｏｔ常见问题及处理总结
阿木
１、wesｔern ｂｌoｔ得优点答: 灵敏,可达ｎg级,用Ｅcl显色法理论上可达pg 级、方便,特异性高。

２、为什么我得细胞提取液中没有目标蛋
白？
答: 原因有很多: a)您得细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b) 您得细胞中得蛋白质被降解掉了,您必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c)您得抗体不能识别目标蛋白,多瞧瞧说明,瞧就是否有问题。

3、我得细胞提取液有得有沉淀,有得很清
亮,为什么呢？
答: a)有沉淀可能因为您得蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长, b) 也不排除您得抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即
可。

４、我做得蛋白质分子量很小(10KＤ),请
问怎么做WＢ?
答:可以选择0。

2μml得膜,同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起,再转移、
其她按步骤即可。

5、我得目得带很弱,怎么加强？
答:可以加大抗原上样量、这就是最主要得、同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏,有什么解决方法? 答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高牛奶浓度、
７、目标带就是空白,周围有背景,就是为
什么？
答:您得一抗浓度较高,二抗上HＲP 催化活力太强,同时您得显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。

将一抗与二抗浓度降低,或更换新底物。

8、我得胶片就是一片空白,就是怎么回
事？
答:如果能够排除下面得几个问题那么问
题多半出现在一抗与抗原制备上。

ａ)二抗得HRP 活性太强,将底物消耗光;b)ECM底物中H２O2,不稳定,失活;ｃ) ＥCＬ底物没覆盖到相应位置;d) 二
抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟与5分钟后,
底片漆黑一片,就是什么原因呢？
答:ａ)可能就是红灯造成得, 胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗得情况下操作.瞧就是否有改善、;ｂ) 显影时间过长。

10、DＡB好还就是EＣＭ好？
答:DAB 有毒,但就是比较灵敏,就是HR Ｐ最敏感得底物;ＥCM结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级抗原。

要瞧
您实验得情况。

１1、抗原检测出得分子量比资料上得大,
就是怎么回事?
答:ａ)抗原形成了二聚体。

增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体、
b)蛋白本身得修饰如:糖基化,磷酸化等１2、蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时M ａｒkｅｒ转上去了,为什么?
答:可能就是:ａ)样品浓度过低;b)转移时
间不够,。

13、磷酸化抗体得检测样本制备时就是否
一定要加NaF等?
答:NａF就是一种广谱磷酸化酶得抑制剂,一般最好加。

但就是不
加也可以,大部分时
候就是不用加得。

1４、要验证某个细胞上有无该蛋白得存在,需要做免疫组化与ｗe ｓｔern ｂｌot 试验不?做这两个试验时得一抗与二抗可
以共用不?
答: ①免疫组化可以用来进行定位,但就是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Ｗestern bｌoｔ可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但就是
不能定位、
②两种实验得一抗有时候不能通用,公司
得产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,就是否适合石蜡切片
或者冰冻切片。

15、做Wesｔern Ｂｌｏt时,提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用得博士德得一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个saｎta cloz得一抗仍不行。

就是什么原因？蛋白酶抑制剂单
加PMSF行不？
答:怀疑就是样品问题,可能就是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂、同时,建议检查WｅsternＢlot过程, 提高一抗浓度、对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSＦ就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

1６、细胞水平要做wesｔern bloｔ,多少细胞提得蛋白够做westeｒｎblot?
答:一般5×10^６就足够了
17、同一样品能同时提RNＡ又提蛋白么？这样对western blｏt 有无影响？
答:能,没有问题。

１8、同一蛋白样品能同时进行两种因子得Ｗestern Blot检测不？
答:当然可以,有得甚至可以同时测几十种
样品。

1９、如果目标蛋白就是膜蛋白或就是胞浆蛋白,操作需要注意什么？
答:如果就是膜蛋白与胞浆蛋白,所用得去垢剂要温与得多,这时最好加上NaＦ去抑
制磷酸化酶得活性。

20、我得样品得蛋白含量很低,每微升不到1微克,但就是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就就是在转膜后染胶发现有得孔所有得蛋白条带都在,只就是颜色变淡了,有什么办法可以解决？答:您可以加大上样量,没有问题,还有转移时您可以用减少电流延长时间,加２０％
甲醇、
21、想分离得蛋白就是分子量20０ｋd得,ＳDＳ—PAGE电泳得分离胶浓度多大合
适？积层胶得浓度又该用多少？这么大分子量得蛋白容易作ＷesteｒnＢｌot
不？
答:200kd得蛋白不好做, 分离胶用7％,积
层胶 3.５%、
22、如果上样量超载,要用什么方法来增加
上样量？
答:可以浓缩样品,也可以根据您得目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。

一般地,超载30%就是不会有问题得。

如果已经超了不少了,而且小分子量得也要,可以考虑加大胶得厚度,可以试试1。

5mｍ得、２3、蛋白变性后可以存放多久? 答:－80℃,一两年没有问题。

最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也就是被酶水解了)。

24、我所测定得蛋白分子量就是1０5KD,按理说分离胶应当采用７。

5％,但资料却要求分离胶与浓缩胶均采用11％得配方, 不知为何?
答:上述提到得两种凝胶均可以使用,因为105KD得蛋白在上述两
种胶得线性分辨范围内,但需注意条带位置。

25、二抗就是生物素化得抗体,三抗就是亲与素生物素体系,不知采用这样得方案后,封闭液就是否要作调整,能否再用5％得脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲与素生物素得生成,就是不?
解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BＳＡ代替应该好一点. ２６、问一般一次上样得蛋白总量就是多少,跟目得蛋白得表达量有关系不？答:Westｅrn Blot一般上样3０-10０微克不等,结果跟目得蛋白得丰度、上样量、一二抗得量与孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。

开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。

要拿到好得结果,如果抗体好得话比较容易,抗体不好得话就需要反复地试了,当然有得不适合Wesｔｅrn Bloｔ得怎样做也不行、２7、做组织样品得ｗesteｒn得时候,怎样
处理样品?
答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈得方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。

还有一点就就是组织中得蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶得活性(加入ＰMSF)。

28、问大分子量蛋白2０0KD,在做wesｔ
ern要注意什么呢?
答:做200kd蛋白得WesterｎBlot时要注意,分离胶最好选择>７％得;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。

29、有什么方法可以提高上样量？答:ａ)可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量;b)用5倍得上样缓冲液来稀释
变性
３０、蛋白得上样量有没有什么具体得要
求？
答:上样量要根据实验得要求来定, 如果要求就是定量与半定量得WesｔｅrｎBlot 则上样量要均等,如果只就是要定性,则没有太大得关
系,尽量多上就行了,
但就是不要超载。

31、一抗,二抗得比例就是否重要? 答:比较重要,调整好一抗,二抗得比例,可以去掉部分非特异得本底、
32、要做磷酸化某因子WesterｎBｌｏt,
其二抗有何要求？
答:对二抗无要求,要瞧您实验条件来选择,一般推荐用ＨＲP标记得二抗。

33、免疫组化与WestｅrｎBｌot可以用
同一种抗体不？
答:免疫组化时抗体识别得就是未经变性处理得抗原决定簇(又称表位),有些表位就是线性得,而有得属于构象型;线性表位不受蛋白变性得影响,天然蛋白与煮后得蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。

如果您所用得抗体识别得就是蛋白上连续得几个氨基酸,也就就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化与Weｓtｅrn,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。

34、WeｓｔernＢlot 中抗体得可以重复
应用不?
答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但就是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。

稀释后应在２—３天内使用,4度
保存,避免反复冻融。

３5、在做Wesｔern Bloｔ时,PＶDＦ膜
用甲醇浸泡得目得?
答:PVＤF膜用甲醇泡得目得就是为了活化PVDF膜上面得正电基团,使它更容易跟带负电得蛋白质结合,做小分子得蛋白转移时多加甲醇也就是这个目得、
３6、检测同一抗体得磷酸化与非磷酸化得抗原可以在同一张膜上不？
答:可以。

37、转膜后经丽春红染色得条带,为什么大蛋白分子得一端得转膜好象不就是很好,
为什么?
答:这就是正常得,大分子得蛋白转移得慢, 您延长转移时间与电流,大分子一端就会好得多,但就是小分子得就有可能会变淡。

３８、做Ｗestｅrn Bｌoｔ时,同样得抗体免疫组化能做出,而Wｅｓtern Bloｔ却不
能？
答:这多半就是抗体得问题,要瞧抗体得说明,就是否能做Western Blｏｔ与免疫组
化。

3９、如果就是６×8转印膜,要加多少一
抗?
答:一抗得稀释度就是有说明得,根据您得一抗瞧瞧就知道了,但就是那么大得膜孵育体积一般最少为３—５ml。

40、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到
最佳效果、
答:无特殊要求。

但我们一般就是上槽放新
鲜得缓冲液,下槽可以就是重复使用过一
两次得缓冲液
41、跑电泳得时候配得胶总就是“缩”就是
什么原因呢?就是有得成分不对不？答:没什么问题,就就是您胶里得水分被蒸发了。

过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了;也可能母液(３0％聚丙酰胺)有问题,您可以重新配制一份观察;能够替换得试剂,尽量换一下,选用好得
试剂。

４2、蛋白质得分子量跨度很大,如要分离小２1KＤ,中至６6KD,大至170KD,可以
一次做好不？
答:这么广得分布不好转移,一般建议:2１kｄ与66kd可以一起转,１２％SＤS—ＰAGE,湿转120mA, 4５—6０min就可以了, 可以根据您实验室得经验调节;170k ｄ用7％SDS－ＰＡＧE,200mA 9０—12
０ｍｉn。

4３、不能很好地将大分子量蛋白转移到
膜上, 转移效率低怎么样解决? 答:可以考虑:转移缓冲液中加入２０％甲醇(就是指终浓度),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质与NC膜得结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0。

1％ＳDS,也就是为了增加转移效率;用优质得转移膜,或使用小孔径得ＮC膜(0、2微米)、４4、我用得就是可视mａrｋｅr,但就是电泳总跑不全8条带,请问什么原因？怎样改善？胶用过8％,1０％,1２%,都就是这样、ｍarker就是新买得。

答:一般来说,就是小分子量Ｍaｒker跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试瞧。

当然梯度胶也就是不错得选择、
4５、就是否Westeｒn Blot实验半定量一定要加ＡCTIＮ内参？
答:对于发表文章得实验最好加内参,实验
严谨。

４６、核内抗原Ｗeｓｔern Ｂlot内参选
择什么合适？
答:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中得表达就是很稳定得,有很多都可以当成内参,在网上查查就可以选出您要得内参。

4７、做半定量WesterｎＢlｏt,内参β—ａcｔiｎ,GＡPDH哪个好?
答:选用betａ—acｔｉn就可以。

48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则不？受不受组织来源得影响？胞膜与胞浆有区别不？
答:一般来说提取时加入广谱得蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。

除非有文献特别指明用特殊得方法,一般来说都没
有区别。

4９、转膜后得脱脂奶粉封闭液就是５％得TＢST脱脂奶粉",其中ＴBSＴ最后那个T就是Tweｅn不,浓度多大？答:就是Tｗeｅn,配方如下:Tris-Ｂuffｅｒed Salｉne Twｅen-2０(TBST),
NaCl:８g, Ｔris bａse:2。

４2ｇ加水８0０mｌ溶解, 加500—１
00０ｕl得Tween-20,用HCl 调节pH至7。

4, 加
水定容至１L。

5０、封闭,一抗,二抗时得温度有没有什么规定呢,比如在室温里做,或者要在4度
下？
答:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后４度
过夜。

５1、请问一下PVDF膜与硝酸膜结合蛋
白得原理就是什么？
答:一般而言,硝酸纤维素膜就是通过疏水作用来与蛋白质相联,这样得话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。

ＰVDF 膜主要通过它膜上得正电荷与蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。

这样得话,PVDF膜与蛋白接合较牢,不易脱落,结
果较好。

52、怎样才能把胶跑得非常漂亮,泳道都能
很直,上样得量与灌胶就是否很重要,电压
有什么要求?
答:影响跑胶跑得质量,有以下几个因素:１、电压,小得电压会使胶得分子筛效应得到充分发挥。

电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55v,分离胶７５ｖ就能跑得很好。

２、胶得均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀、倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层得分离胶、53、为什么提高大分子量蛋白得转移得时候,小分子量蛋白会丢失一些哪？什么原
因？
答:小分子得蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子得上去以后,有一部分小分
子得就透过去了。