微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用_徐莉

西北植物学报2002,22(3):714—722
Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.
文章编号:1000-4025(2002)03-0714-09
微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用①
徐　莉,赵桂仿
(西北大学生命科学学院,西安710069)
摘　要:微卫星DN A的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性,使其成为居
群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记。

本研究系统介绍
了微卫星DN A在结构和功能上的特点,并对微卫星DN A标记技术应用的遗传学机理和一
般方法进行了扼要的阐述。

另外,本研究还探讨了微卫星DN A标记技术在遗传多样性研究
中的应用现状,并进一步提出其发展前景。

关键词:微卫星DN A;微卫星DN A标记;遗传多样性
中图分类号:Q946.33 文献标识码:A
Microsatellite DNA marker and its application
in genetic diversity research
XU Li,ZHAO Gui-fang
(Colleg e of Life Science,Nor thw est University,Xi an710069,China)
Abstract:Beca use of its hy pe rva ria bility,neutra lity,co-do minance and ubiquity in eukary otic g eno mes, micr osatellite DN A is becoming pr efer red mo lecula r mar ker for po pulatio n g enetic studies,a s w ell a s fo r strain identification,kinship analy sis,and mapping pur po se.Th e paper presents th e structural and func-tio na l charac teristics o f micro sa telli te DN A sy stema tically,and show s the genetic mecha nism fo r applica-tio n of micr osatellite DN A mar ker and its gener al me tho ds.It is also discussed that micro sa tellite DN A mar ker is utilized in ge netic div ersity r esea rch now aday s and its develo pment in the futur e.
Key words:micr osatellite DN A;mic rosatellite DN A mar ker;g enetic div ersity
物种的灭绝,遗传多样性的丧失,生态系统的退化和瓦解,使生物多样性研究成为目前的一个热点。

其中,遗传多样性水平不仅制约着生物适应性进化速率,而且是人工育种和生物多样性保护实践的前
①收稿日期:2001-07-09;修改稿收到日期:2001-11-07
基金项目:国家“973”重大基础项目资助课题(G199********)
作者简介:徐　莉(1974-),女(汉族),现为西北大学生命科学学院博士生。

提,因此遗传多样性水平的测度就成了生物多样性研究中的一个核心问题[1]。

20世纪90年代发展起来的微卫星DN A 标记技术,是利用在所有真核生物中广泛存在的微卫星多态性位点进行生物遗传多样性、亲缘关系分析、图谱构造及群体遗传结构研究的新方法。

1　微卫星DN A (Microsatellite DN A)与微卫星DN A 标记(M icrosatelli te
DN A marker )
大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一,而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上。

植物基因组中一般含有50%以上的重复序列,如小麦基因组的重复序列多达80%。

重复序列按其在染色体上的分布方式,可分为散布重复序列(Dispe rsed Repea ts Seque nce,简称D RS)和串联重复序列(Tandem Repeat Sequence ,简称T RS )。

前者的重复单位与其它无关重复序列和单拷贝序列相间排列。

而后者的重复单位则首尾相连,成串排列[3]。

按照重复单位的大小又可以将串联重复序列分为卫星序列(Sa tellite)、小卫星序列(M inisa tellite )和微卫星序列(Micro satellite)3种。

微卫星DN A 是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。

微卫星DN A 也称简单串联重复序列(Simple Sequence Repeats,简称SSRs)或简单串联重复序列多态性(Shor t T andem Repeat Po ly mo r-phism ,简称ST R P)。

这些位点由非常短的串联重复DN A 片段(1到5个碱基)组成。

微卫星DN A 最早是在人类基因组研究中发现的,它极其丰富,分布在整个基因组中[5]。

人类基因组最普遍的微卫星是那些含有A 、AC 、AA AN 、A AN 或AG (这里N 代表G 、C 或T )的序列。

这5组重复序列大约占到人类基因组微卫星总量的75%。

接着,微卫星DN A 序列在大多数的其它动、植物基因组中也先后被发现,并且还通过聚合酶链式反应可以方便地确定其类型[6]。

(A T )n 和(A T T )n 是首先于大豆中发现的在不同的株系中长度有所不同的重复序列,它们也是第一个被定位的植物微卫星座位。

在马铃薯的序列数据库中也存在(G A)n 、(CG)n 和(A T )n 的串联重复序列。

目前在拟南芥中已有78套微卫星DN A 标记被鉴定出来。

据统计,在真核生物中大约每隔10～50kb 就存在1个微卫星[7]。

W ang 等[8]发现微卫星序列中所有的单、双和四核苷酸重复序列都分布在DN A 非编码区,而含G-C 碱基对的三核苷酸重复序列有57%位于编码区。

微卫星重复序列在植物中出现的几率比动物中少得多。

在植物中,约29kb 中有20bp 的微卫星序列[9],例如鹰嘴豆中(T A A )n 、(G A )n 和(CA )n 序列在平均60kb 的长度中出现于12000个位点上[10];而动物中,约每6kb 中就有20bp 的微卫星重复序列。

另外,研究还发现植物中最丰富的微卫星是(A )n ,其次是(A T )n ,再次是(G A )n 。

W ebe r [11]将微卫星分为3类:完全重复(无间隔)、不完全重复(有非重复单位的碱基间隔)和复合重复(2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现)。

M ag uire 等[12]在对Av icennia marina 微卫星位点的特征分析中发现,获得的微卫星重复序列中完全重复、不完全重复和复合重复各占50.0%、24.2%和15.0%。

同时他们指出,在Av icennia marina 的基因组中A C /T G 重复序列出现的频率最高,这与在其它植物中富含A G /T C [13]的情况不同,然而与松属的二核苷酸重复序列频率最近的研究结果[14]相一致。

这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知的过程来改变它们的长度,从而导致微卫星在数量上的差异[15,16]。

微卫星的突变率高:每代每个配子的每个位点有 2.5×10-5～1×10-2突变[17],因此造成了它们的多态性。

但微卫星周围的单拷贝序列一般不受其影响。

Dav ie r-wa la 等[18]对水稻及其近缘种利用(G A T A )n 和(AC)n 微卫星两侧的序列合成的引物进行PC R 扩增,再通过克隆、测序获得了大小不等的8个等位基因。

测序分析的结果表明,不同等位基因的大小变异是由于微卫星重复数目的变异和微卫星两侧区域的序列的变异。

同时他们为了研究其它禾本科植物对水稻中包含有微卫星的O S1E69位点的表达情况,重新利用前面合成的微卫星引物对其它禾本科植物进行分析,发现这些不同基因型的禾本科植物在该位点上也表达,说明其具有保守性。

Choumane 等[19]在对Cicer 属8个一年生种和1个多年生种的90个微卫星侧翼序列的研究中,发现所有引物均能在鹰嘴豆7153期徐　莉等:微卫星DN A 标记技术及其在遗传多样性研究中的应用
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的近缘种中成功扩增,也表明微卫星侧翼序列具有保守性。

实验结果还显示,随着物种与鹰嘴豆的系统发育关系的变化,引物位点的保守程度在种间存在差异。

其范围从C.reticulatum中的92.2%(它与鹰嘴豆的亲缘关系最近,是鹰嘴豆的可能祖先)下降到C.cuneatum中的50%。

Choumane等在文中还提出微卫星两侧的序列是扩增成功的必需条件,对一个单引物位点而言,其平均突变率是10000年4%即每年4×10-6。

这一结果比微卫星自身突变率要低一些[17]。

Roa等[20]通过10对微卫星引物检测木薯的7个种121个个体的124个等位基因,得出结论:尽管这些微卫星引物在整个属中均可以使用,但是随着遗传距离的增加,扩增位点的成功率趋于降低。

然而,为了在更多物种中能够以较低的投入应用微卫星标记开展研究工作,大量学者尝试在不同的物种间通用微卫星引物,从而使由少数模式生物(如拟南芥等)中获得的遗传信息迅速应用到许多经济价值大,但基础理论研究薄弱的植物中去[21]。

尽管目前对这些重复序列的功能和起源还不清楚,但许多研究已经证明,重复序列可以作为种或基因组水平的遗传标记,是分子水平上研究遗传多样性的一个有力工具。

微卫星序列的重复单位小,而且这些重复单位的序列差异和数目变化能够形成丰富的多态性,因此得到了广泛的应用,已成为取代RFL P(Restrictio n F rag ment L eng th Po ly mo rphism)的第二代分子标记。

微卫星通常是复等位的,代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。

微卫星寡聚核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大[22]。

如Ro ngw en等[23]发现大豆的SA T1位点上有26个等位基因,D.Str uss等[24]的研究则表明大麦中每个微卫星标记的等位基因数目从5到15不等,平均每个位点8.6个等位基因。

另一方面,在每个微卫星DN A两端的序列多是相对保守的单拷贝序列,尤其在亲缘关系相近的物种间是保守的。

例如,人类微卫星标记可用于黑猩猩相应位点的扩增[17],而牛的微卫星标记的等位基因位点也可用于山羊和绵羊的研究[25～27]。

微卫星标记的可传递性在Canidae[28]、Cetaceae[29]、松属不同种[30～32]及苜蓿属[33]的研究中得出相同的结论。

因此可根据两端的序列设计一对特异的引物,然后利用P CR扩增每个位点的微卫星序列,经电泳比较扩增产物的长短变化,即可显示不同基因型的个体在每个微卫星DN A位点的多态性[34]。

进一步研究还发现,微卫星DN A是中性的,而且微卫星DN A标记呈共显性的孟德尔式遗传[35～37]。

它具有比其它分子标记(如等位酶、RF L P、RA PD等)更多的可检测等位基因,能够提供更细致的基因变化分析范围。

该方法在居群遗传学研究中表现出很大的潜力[38]。

W u和Ta nksley[37]在20个水稻品种中检测到微卫星等位基因达11个,同时使用一般R FL P分析等位基因数小于4个。

可见,微卫星DN A的多态性比RFL P显著增高。

Russell等[39]也曾对几种分子生物学方法(RFL P,A FL P,R APD,SSR)进行了比较,分别检测18个大麦品系的遗传多样性水平的变化情况,发现所有这些方法都能鉴别每一个品系,但各自反映的多态性程度不同。

其中利用微卫星标记的13对引物产物全部呈多态,平均每一对引物有 5.7个等位基因。

AF L P、RFL P与RA PD多态性片段分别为36.4%、83.2%和66.3%。

微卫星DN A 具有高度多态性,同一遗传位点数目变化很大,并能在群体中形成多达几十种的等位基因,这是其它遗传标记所不能比拟的;此外,PCR技术的利用使微卫星标记技术实现操作自动化。

微卫星作为遗传标记已使人类基因组的遗传制图和连锁分析发生了革命性的变化。

至今,所建立的遗传图谱中已含有6000多个以微卫星DN A为主体的遗传标记,其平均分辨率为0.7cmo l/L(厘摩尔根),即2个位点之间有0.7%的几率可以重组。

目前,微卫星标记系统是基因定位中研究最多的标记系统。

2　微卫星标记DN A技术的实践方法及发展
通过PCR扩增并使用凝胶电泳分离产生大量含有微卫星DN A片段的方法有3种:(1)用在3′端或5′端被放射性标记的微卫星DN A引物做PCR;(2)用微卫星DN A两端的保守序列做P CR;(3)用被放射性标记的微卫星DN A引物和RA PD随机引物共同扩增含微卫星DN A的序列和随机序列。

其中第2种方法最为普遍,它一般可分成4个步骤。

①微卫星序列　通常有2种途径:一是从基因组文库中获得含有微卫星的阳性克隆;一是通过检索Genbank(美国基因、蛋白数据库)、EM BL(欧洲分子生物学实验室数据库)和DDB J(日本国家遗传研究所基因数据库)等DN A 序列数据库,从互联网上获得含有微卫星的序列。

前者获得微卫星DN A 标记需要建立、筛选基因组文库和克隆测序等一系列实验,消耗大,工作量也大[36]。

而通过后者可以直接快速地获得微卫星标记,是对上一种途径的有效补充。

随着基因组计划的全面展开,新的序列大量地进入数据库,用此方法将能较容易的获得更多标记,将可能成为获取微卫星DN A 标记的一个主要途径[40]。

②微卫星引物　微卫星两侧的序列对于同一物种高度保守,因此可以使用与两侧保守的DN A 序列相互补的方式设计特定的寡聚核苷酸引物。

实验室中通常采用两种方式得到所需微卫星引物:可以通过检索所研究物种GeneBa nk 等数据库查找带简单重复的DN A 序列,用Primer 0.5(nder ,M as-sa chusetts Institute o f Techno lo g y)及M acV ecto r 6.0(Ox fo rd M o lecula r Limited)等软件设计引物;另外,也可以直接应用若干已发表的微卫星标记引物。

在基因组内具有高度专一性的微卫星引物一般为18～24个核苷酸,(G +C)%含量接近50%～60%(Tm 值为60℃左右),退火温度常在55℃～72℃下进行。

研究表明提高退火温度可以增加引物与模板结合的特异性。

特别在最初几次循环中采用严谨的退火温度,有助于PCR 特异性扩增。

其次,为了避免引物内二级结构的产生及某个核苷酸的连续出现,3′末端最好富含GC 。

③微卫星PCR 扩增　由于是特异性扩增,所以其重现性和稳定性相对较好。

但是随着每对引物(G +C)%含量的不同和扩增片段长度的不同,与每对引物相对应的合适的扩增条件也不同。

通常采用改变退火温度、缓冲液中M g 2+浓度及循环数等来获得清晰可靠的条带。

Taut z 等[5]在研究中发现,当第一对引物扩增到后期时,可通过加入另一个与目标序列互补的引物来去除那些由于引物与其它位点的同源性而产生的非相关性扩增条带。

另外他们还指出,尽管通过多次预实验来改变反应条件,也不能完全避免某些PCR 扩增所导致的假带。

④微卫星扩增产物检测　微卫星经过PCR 扩增所得产物在100～300bps 之间,而且基因型间的差异仅为几个bps 。

因此一般采用3种方法进行分离[12]:Ⅰ高浓度(3%～4%)的琼脂糖凝胶电泳,利用溴化乙锭染色;Ⅱ非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用银染法来检测,分辨率较高;Ⅲ将PCR 产物进行荧光标记(如F AM ,T ET ,HEX 等),然后经高温变性,在PE Applied Biosy stems 310等遗传分析仪上利用毛细管电泳分离,并通过Ge ne Scan 和Geno Ty pe r(PE Applied B io systems)等软件进行分析。

随着研究的不断深入,在微卫星标记的基础上发展起来几种相近的分子标记:1)ISSR [41](Inter -Simple Sequence Repeat )技术,也称A SSR(Ancho r ed-Simple Sequence Repeat ),是一种类似RA PD,但利用包含重复序列并在5′端或3′端锚定单寡聚核苷酸引物对基因组进行PCR 扩增的标记系统。

与微卫星分析相比,ISSR 不要求预知基因组序列信息,大大减少了多态性分析的预备工作。

同时它在模板的用量,实验繁琐程度和费用上也占有优势。

其缺点在于ISSR 为显性遗传标记,不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。

但是对于父系分析、估计异交率和克隆植物多样性这类基于基因型鉴定的居群遗传学和分子生态学领域,标记体系的显性遗传方式并无太大影响。

而且在其它方法不能获得多态位点的情况下以及绝大多数缺乏分子遗传学研究背景的濒危植物遗传多样性水平评价中,I SSR 可发挥极为重要的作用[42]。

2)把SS R 互补的寡聚核苷酸作为多位点的RFL P 技术中的探针。

3)R AM S,用标记的SSR 探针与R APD 扩增片段杂交。

4)R AM PS,把与SSR 互补的寡聚核苷酸作为PCR 引物,扩增基因组特定片段。

3　微卫星DN A 标记在遗传多样性研究中的应用
保护生物多样性的核心内容就是保护生物的遗传多样性。

遗传多样性是一个需要用种、变种、亚种或品种的遗传变异来衡量其内部变异性的概念。

遗传多样性为物种和个体的适应及进化提供原材料。

遗717
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传多样性的保护实质上就是在基因和基因组水平上的保护。

如果动、植物的遗传多样性得不到应有的保护,一个物种的灭绝就意味着将有难以数计的遗传多样性的消失。

伴着人类对自然资源的开发利用,自然生态系统被大面积破坏,加之环境污染等,使得物种灭绝的速度加快。

物种多样性是人类赖以生存和发展的基础,评估物种受威胁程度以及是否已摆脱受威胁的状态必须建筑在遗传多样性研究的基础上。

建立濒危物种有效保护策略的一个首要条件就是在未受到广泛干扰前获得有关其遗传结构的知识。

然而由于从濒危物种中获得具有遗传学意义的样本,在操作上存在许多困难,所以对于它们精确的遗传多样性及遗传结构信息了解甚少。

近年来,生物化学和分子生物学技术得到了迅猛地发展,使这一难题部分地得到了解决。

一些相对简便且花费不高的分子生物学方法为更好地组织群体内部有用的遗传变异提供信息。

DN A是生物体内的遗传物质,因而它能更加直接的反映群体内及群体间的相关(似)性。

利用DN A分子标记技术可以有助于从本质上揭示物种遗传变异及其变异规律,预测物种的命运,从而制定相应的管理措施。

W yman和W hite[43]于1980年提出了DN A指纹的概念,自此,DN A指纹分析成为遗传分子标记中的主要方法。

而微卫星DN A标记技术是DN A指纹技术中极具潜力的分子标记,是目前最为先进的遗传标记系统之一。

同时,对于植物种以下水平的研究,一方面要了解其中的遗传多样性水平和居群间的相互关系,另一方面还要统计分析居群的遗传结构、等位基因频率以及居群间的遗传分化等。

因此,必须选择灵敏的分子标记,从而能够提供足够多的遗传信息,更重要的是所获得的信息要重复性好、可比性高、稳定可靠,且结果便于分析。

微卫星DN A标记即是符合了这些要求的分子标记之一。

作为新一代的分子标记,微卫星已被用于多种植物的遗传多样性研究,例如:拟南芥[36]、大麦[44,45]、Brassi-ca napus[46]、玉米[47]、大豆[48]、水稻[37,48]、番茄[49]和小麦[50,51]等。

微卫星DN A标记是进行物种亲缘关系研究及遗传多样性分析的有效工具。

一系列的研究结果表明,微卫星等位基因数目与重复单位数目有明显的正相关,它能更加有效地揭示遗传多样性,而且特别适用于其它类型标记所揭示变异水平低的物种。

尤其是对于源自野生杂交的物种(如小麦,水稻等),它们的基因图谱往往需要能够包含更多信息量的遗传标记。

众所周知,小麦的基因图谱构建过程中,由于RFL P标记在小麦中仅有<10%为多态,因而曾造成一度进展缓慢[52～54]。

微卫星标记的出现则有力地推动了这一工作。

Ro de r等[51]率先将微卫星标记技术应用于六倍体面包小麦的研究,初步显示了微卫星标记比其它标记系统更高的多态性和更大的信息量。

之后,他们又进行了深入的研究,确定并发表了230对多态性引物,而且进一步利用微卫星标记绘制出了包含分布在7个部分同源染色体组的279个微卫星位点的小麦遗传图谱[55]。

在水稻中约存在5700～10000个微卫星,并随机分布于全部的12对染色体上。

另外,利用这种标记技术可有效地对外源遗传物质进行检测、跟踪和定位。

刘国庆等[56]选用160对微卫星引物对20个栽培稻与紧穗野生稻间进行鉴定分析,有127对扩增出明晰的条带,其中108对在紧穗野生稻与栽培稻亲本间存在多态性。

这种丰富的多态性也使得大多数微卫星引物可用于跟踪栽培稻背景下外源遗传物质的渗透。

由于微卫星DN A在1个位点上重复单位的数量在居群内和居群间可以产生有意义的改变,所以微卫星DN A标记技术受到居群遗传学家的普遍关注[57]。

在缺乏其它自然变异的特征时,微卫星等位基因频率的数据可以用来探讨解决亲缘关系[58]、同源概率[59]和居群结构[60]等问题。

Roder等[51]证明某些W M S(W heat Micro satellite)能够被用于黑麦或大麦的多态性检测。

在最近的研究中,Peil等[61]应用W M S来鉴定山羊草(Aequilos mark graf ii)染色体和检测两个山羊草品系的多态性。

刘杰等[62]采用两种方法分别利用人工合成的SSR寡聚核苷酸作为探针和引物,对羊草基因组DN A进行分析并构建了羊草的遗传指纹图谱。

实验中发现,用短微卫星重复序列作为探针与来自于cDN A片段、基因组DN A片段和直接从染色体上克隆的DN A片段的单位点探针比较,更容易研究植物自然居群的遗传结构和无性系的鉴定[63]。

在对大麦的研究过程中,微卫星标记高度的多态性允许快速、有效地鉴定不同大麦的基因型[24],大麦中微卫星标记的基因多样性值平均大于0.73。

类似高的基因多样性也在对其它植物的研究中被报道[23,44]。

Olsen和Schaa l[64]利用5个不同的微卫星位点,分析木薯的系统发育过程,验证了早先
的研究结论并进一步阐述了木薯野生近缘种的遗传结构。

另外,他们还最早将微卫星数据与植物居群结构分析中的种内基因谱系进行了比较。

在种质资源保护方面,微卫星DN A 标记技术为种质资源保护提供了有力工具。

由于生态环境的破坏和恶化,许多物种已经或正在消失;还有一些物种由于长期用于人工移植和杂交,其原产地及不同性系之间的界限用传统的方法很难确定。

借助分子标记,通过物种分子遗传图谱的构建、群体遗传结构和多样性分析、物种演化和亲缘关系研究,能够对不同物种进行精确的系统学的区分,精确确定物种的进化途径和分类学地位,进而对种质资源、基因库进行有目的的保护。

微卫星DN A 分子标记技术将成为生物进化、分类学研究和种质资源保护最主要的手段。

张亚平等[65]用微卫星DN A 进行圈养大熊猫的亲子鉴定,发现在一雌多雄交配过程中,只有个别雄性是有效的。

该研究还结合基因型的鉴定,制定繁殖计划,防止近交衰退。

微卫星标记在遗传多样性研究中,特别是在居群遗传学中的广泛使用已经形成了一个较为完整的体系。

然而对于微卫星遗传分化的量化方法目前具有争议[66～69]。

在遗传多样性研究中通常使用统计学方法如遗传距离[70]、聚类分析[71]、PIC 值[72]、基因多样性[73]等来做进一步分析和讨论。

同时,为了提高对微卫星DN A 标记量化分析的效率,还可以采用多对引物反应(M ultiplex PCR )或多次点样的办法[40]。

4　结束语
我国科学工作者近年来运用微卫星标记等新技术,从遗传多样性角度确定了一些野生珍贵动、植物的进化和分类地位;还探讨了某些物种的濒危原因,并提出就地保护和迁地保护的遗传管理方法。

对一些经济动、植物遗传多样性的探讨,在了解它们的起源和品种分化、品种鉴定和评比、指导育种等方面都具有重要的参考价值,这也为现代生物学技术实现对基因进行分离和转移奠定了基础。

随着遗传多样性研究的进一步深入,微卫星DN A 标记技术将会得到更加充分的应用,展示其更强的生命力。

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