菊花多糖两种测定方法的比较研究

安徽科技学院学报,2010,24(6):33~36
Journa l o f Anhu i Sc i ence and T echno logy U n i versity
菊花多糖两种测定方法的比较研究
李文超,李俊龙,沙伏生,王勇,陈会良
(安徽科技学院动物科学学院,安徽凤阳233100)
摘要:采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测定菊花多糖含量,分别对两种测定方法的稳定性、重复性、回收率进行比较,以期选出一种比较准确、方便的菊花多糖的测定方法。

结果显示,苯酚-硫酸法在测定菊花多糖含量上优于蒽酮-硫酸法。

关键词:菊花;多糖含量;苯酚-硫酸法;蒽酮-硫酸法
中图分类号:S567文献标识码:A文章编号:1673-8772(2010)06-0033-04
Co m parison of Two M et hods i n Deter m i nation of Pol ysacc haride Contents of Chrysanthe mu m mori foliu m Ra mat
LIW en-chao,L I Jun-long,SHA Fu-sheng,WANG Yong,C H E N H u i-liang
(C ollege o fAn i m al Sc i e nce,Anhu i Science and Techno logy U niversity,Fengyang233100,China)
A bstract:The po l y sacchari d e contents of Chr y santhe m um m orifolium Ram at were deter m i n ed by pheno l-sulf u ric ac i d m ethod and an t h rone-sulfuric ac i d m ethod in t h is paper.In o r der to se lect a m ore accurate and convenient deter m inati o n i n Chry s an t h e m um m ori f oli u m R a m at,the stab ility,repeatability,recovery rate o f the t w o m ethods w ere co m pared.The result sho w s that pheno l-sulfur ic acid m ethod is better than anthr one-su lfuric ac i d m et h od in the deter m inati o n of po l y sacchari d e content o f Chry s an t h e m um m orifo lium Ramat.
K ey words:Chr y santhe m um m ori f oli u m Ram at;Polysacchari d e conten;t Pheno l-su lfuric acid m ethod
菊花是菊科植物菊(Chrysanthe mum m ori f olium R a m at)的干燥头状花序,为多年生草本,性味甘苦、凉,具有疏风、清热、明目、解毒的功效,主治头痛、眩晕、目赤、心胸烦热、疥疮、肿毒等[1]。

菊花多糖是从菊花中提取的水溶性多糖。

研究证实菊花多糖是一种良好的氧自由基清除剂,具有良好的预防保健作用[2]和免疫调节功能[3]。

目前,多糖的检测方法可分为两大类。

一类是直接测定多糖本身,如高效液相色谱法和酶法;另一类是利用苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法、3,5-二硝基水杨酸法等测定多糖。

前者需昂贵的仪器、多糖纯品和特定的酶,而且操作繁琐,在应用中受到限制;后者方法简单、快速[4]。

但目前尚未见到针对菊花多糖含量的测定研究的报道,本研究旨在通过对苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的对比,以选定一种适合测定菊花多糖含量的方法。

1材料与方法
1.1材料
亳州菊花,购自亳州中药材市场,经鉴定为D.m ori f oli u m(Ramat.)Tzvel./Boju0。

菊花粉碎后经脱脂、自然风干,作为菊花多糖提取试验材料。

收稿日期:2010-01-10
基金项目:安徽科技学院引进人才专向基金项目(ZRC200678)。

作者简介:李文超(1979-),男,河南省南阳市人,硕士,讲师,主要从事动物寄生虫病与中兽医药研究。

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1.2试剂
葡萄糖(105e恒温烘干至恒重);苯酚;浓硫酸(98.08%);氯仿;正丁醇;蒽酮;无水乙醇等试剂,均为国产分析纯。

1.3试验设计
1.3.1菊花多糖的提取、醇沉及纯化工艺称取菊花10g,按照固液比为20:1,提取时间为4h,提取温度为95e,提取次数为3次,进行多糖的提取,之后按乙醇体积分数为80%,药液的浓缩程度为1:3,醇沉时间9h进行醇沉,醇沉后定容到100mL,然后取10mL用Sevage法除蛋白,工艺为氯仿与正丁醇的配比为5:1,样品和氯仿-正丁醇的体积比为2:1,纯化时间为10m i n进行纯化,纯化液定容至500m L待用。

同时做一平行试验。

1.3.2标准曲线的绘制
1.3.
2.1苯酚-硫酸法准确吸取0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL的0.1g/L标准葡萄糖溶液分别置于7个干燥的比色管中,各加水补至1.00mL,然后加入5.53%苯酚1.00mL,浓硫酸5.00mL,摇匀,静置,冷却至室温,于490nm处测其吸光度值。

1.3.
2.2蒽酮-硫酸法准确吸取0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL的0.1g/L标准葡萄糖溶液分别置于7个干燥的比色管中,各加水补至1.00mL,在冰浴中加入新鲜配制的0.1%硫酸蒽酮试剂4. 00m L,摇匀,置沸水浴中加热10m i n,取出,冰浴冷却,静置40m i n后于620n m处测定吸光度值。

1.3.3样品测定
1.3.3.1苯酚-硫酸法取样品液1.0mL于3个干燥的比色管中,然后加入5.53%苯酚,浓硫酸5.00 mL,摇匀,静置,冷却至室温,于490n m处测其吸光度值。

1.3.3.2蒽酮-硫酸法各取同一样液1.0mL于3个干燥的试管中,在冰浴中加入新鲜配制的0.1%硫酸蒽酮试剂4.00mL,摇匀,置沸水浴中加热10m i n,取出,冰浴冷却,静置40m in后,于620nm处测定吸光度值。

1.3.4精密度试验
对同一样液平行取7份,分别用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法按样品测定法测其吸光度值。

1.3.5回收率试验
1.3.5.1苯酚-硫酸法分别吸取同一样液0.5mL于6个干燥的试管中,各加入0.00、0.10、0.20、0.
30、0.40、0.50mL的0.1g/L标准葡萄糖溶液,补水至1.0mL,按样品测定法测其吸光值。

1.3.5.2蒽酮-硫酸法同苯酚-硫酸法。

1.3.6稳定性试验分别用2种方法将样品进行显色,按样品测定法每隔20m i n测其吸光度值。

2结果与分析
2.1各方法标准曲线回归方程及相关性
图1苯酚-硫酸法标准曲线图2蒽酮-硫酸法标准曲线
以系列标准葡萄糖溶液吸光值为纵坐标,质量浓度(L g /mL)为横坐标绘制标准曲线,分别计算出回归方程,苯酚-硫酸法为A =0.2273C -0.2599,R 2
=0.9975;蒽酮-硫酸法为A =0.1359C -0.1660,R 2
=0.9915。

结果表明,葡萄糖在10~70L g /mL 范围内其浓度与吸光度线性关系良好,符合要求,其中A 为吸光值,C 为葡萄糖浓度,标准曲线分别见图1和图2。

2.2 样品含量的测定结果
样品含量测定的结果显示,对同样的样品而言,苯酚-硫酸法测得的多糖含量较蒽酮-硫酸法高,见表1和表2。

表1 苯酚-硫酸法样品多糖含量测定结果
吸光度(A )
质量浓度(L g /mL )
样品重(g)
含量(%)重复平均值
含量平均值
平行1
0.58036.95101.8480.580
36.95101.8481.846
0.578
36.86101.843平行2
0.57536.73101.8370.57636.78101.8391.8540.597
37.70
10
1.885
1.850
表2 蒽酮-硫酸法样品多糖含量测定结果
吸光度(A )
质量浓度(L g /mL )
样品重(g)
含量(%)重复平均值
含量平均值
平行1
0.18926.12
10
1.3060.19326.42101.3211.310
0.188
26.05101.303平行2
0.19026.20101.3100.19026.20101.3101.305
0.186
25.90
10
1.295
1.308
2.3 精密度试验结果
精密度试验结果显示,苯酚-硫酸法对同一样品重复测定7次,标准偏差为0.68,而蒽酮-硫酸法对同一样品重复测定7次,标准偏差为1.33,说明苯酚-硫酸法精密度好于蒽酮-硫酸法。

见表3和表4。

表3 苯酚-硫酸法精密度试验结果
编号1234567吸光度(A )
0.5320.5180.5350.526
0.5280.545
0.565糖浓度(L g /mL )34.84
34.22
34.97
34.5834.66
35.41
36.29
平均值(L g /mL )
35.00标准偏差
0.68
表4 蒽酮-硫酸法精密度试验结果
编号1234567吸光度(A )
0.2060.2020.2100.232
0.200
0.198
0.245糖浓度(L g /mL )27.37
27.08
27.67
29.2926.93
26.78
30.24
平均值(L g /mL )
27.91标准偏差
1.33
2.4 回收率试验结果
回收率试验结果显示,苯酚-硫酸法的相对误差为?1.65,而蒽酮-硫酸法的相对误差为?4.16,见表5和表6。

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第24卷第6期 李文超,等 菊花多糖两种测定方法的比较研究
36安徽科技学院学报2010年
表5苯酚-硫酸法回收率试验结果
编号样品量(L g)标准品量(L g)测定值回收率(%)相对误差
118.500018.805101.6491.649
218.5001028.557100.2000.200
318.5002038.05198.834-1.166
418.5003048.21499.410-0.59
518.5004058.801100.5150.515
618.5005068.918100.6100.610
表6蒽酮-硫酸法回收率试验结果
编号样品量(L g)标准品量(L g)测定值回收率(%)相对误差
113.080012.82498.043-1.957
213.0801024.039104.1554.155
313.0802033.464101.1601.160
413.0803041.79597.017-2.983
513.0804054.843103.3213.321
613.0805062.00798.299-1.701
2.5稳定性试验结果
稳定性试验结果显示,苯酚-硫酸法的RSD为0.9383%,蒽酮-硫酸法的RSD为7.8409%,表明在120m i n内苯酚-硫酸法的稳定性比蒽酮-硫酸法要好。

表7样品稳定性试验结果
编号12345678时间(m i n)02040506080100120RSD(%)苯酚法0.5130.5210.5270.5150.5170.5200.5240.5150.9383蒽酮法0.3920.3860.3750.3750.3730.3770.3210.3187.8409
3讨论
苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法是测定糖含量的经典方法,采用这两种方法测定多糖的含量均能得到理想的结果[5-7]。

但本次试验中,苯酚-硫酸法测出菊花中多糖的含量为1.850%,方法精密度标准偏差为0.68,回收率为98.834%~101.649%,相对误差为?1.65,稳定性RSD为0.9383%,而蒽酮-硫酸法的多糖含量分别为1.308,方法精密度标准偏差为1.33,回收率为97.017%~104.155%,相对误差为?4. 16,稳定性RSD为7.8409%,从各方面的数据分析比较,采用苯酚-硫酸法测定结果比较稳定,因而可认为苯酚-硫酸法是测定菊花多糖含量较为理想的方法。

但是苯酚-硫酸法存在一定的缺陷,如该方法测定多糖含量时,无法去掉单糖成分的干扰,测定结果比实际含量偏高,而且实验中用到硫酸,硫酸遇水剧烈放热,从而显色条件难以控制,影响测定结果,导致线性考察不稳定,高浓度硫酸具有严重的腐蚀性,不便操作[4],苯酚容易氧化,见光或遇氧即逐渐氧化成淡红色,因此在实际测定工作中,要注意避光或迅速操作,以获得理想的实验结果。

参考文献:
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(责任编辑:李孟良)。