细菌形态学检查

每天质控与标本同步进行
染色方法 质控菌株
结果
革兰染色 抗酸染色
ATCC25923（金黄色葡萄球菌） 紫色
ATCC25922（大肠埃希菌）
红色
ATCC14468（耻垢分枝杆菌） ATCC25922（大肠埃希菌）
红色 蓝色
一年一次人员比对，以当次比对职称最高人员结果为参考 标准
阅片
如何阅片
✓ 标本合格与否的判定 ✓ 感染的确认（炎症细胞） ✓ 炎症性质的鉴别（单个核、分叶核或嗜酸细胞） ✓ 感染性质鉴别（细菌、真菌、螺旋体、寄生虫等） ✓ 微生态失衡与否及程度（菌群失调） ✓ 可疑致病菌的确认（根据微生物与炎性细胞的关系）
莫拉菌铜绿假单胞菌、不动杆菌等）需结合镜下涂片及病人临床信息 判断是否为致病菌。 直接涂片镜下观察
白细胞内吞噬细菌与感染相关度高 粘液丝缠绕或包裹的细菌可能为目的菌 未发现吞噬现象可结合标本类型、质量，细菌是否有荚膜，菌群 改变或异位大量定植等分析
谢谢
脓液：同痰涂片 大便：取粘液便或血便少量均匀涂布玻片，不可过厚 无菌体液：标本足量，>1ml，离心或甩片集菌后涂片(3000r/min 15min）
标本量少，直接涂片 病灶组织或干酪块：先用组织研磨器磨碎后再涂片，大小厚度同痰涂片，
注意丝状真菌
质量控制
✓ 涂片的厚薄以镜下见到单层细胞为宜
✓ 染色结果 细胞核、浆清晰，胞内吞噬物清 楚可见
合格的片子肉眼观察痰膜呈亮蓝色，无红色斑块
镜检
抗酸菌呈红色，背景及其他菌呈蓝色
抗酸染色注意事项
染色时避免玻片上的染液干燥 直接涂抹的痰膜厚薄适宜，以透过痰膜看报纸上的5号字迹较模糊为
适宜的厚度 香柏油能溶解复红染料，使萋-尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，
对油镜头造成伤害，故避免使用香柏油，应使用专用油镜油 酸性酒精用尽，可自制5%的盐酸酒精作为脱色液 有时同一个抗酸菌体上，红色的深浅亦有不同，镜检时注意 冬季室温过低，染色时间适当延长 试剂用完后及时盖好，避免挥发 注意生物安全，自我防护
革兰染色注意事项
注意取材部位，涂片的厚薄。 染色时间应视标本种类、涂片厚薄调整，妇科白带标本染色时间应
烧延长（>10s）,以获得更好的染色效果。脱色不宜过度。 固定不可用酒精灯直接加热，避免影响染色效果。 染液用完后及时改上盖子，避免挥发。 被检菌的培养条件、培养基条件、菌龄的不同影响染色效果，如培
✓ 革兰染色阴、阳性分明
涂片的制备水平及染色的质量，直接影响到镜检的结果
标本染色方法及技巧
根据检测目标的不同选择最适合的染色方法
病原体
染色方棉蓝
新型隐球菌
墨汁染色
结核分枝杆菌
抗酸染色、荧光染色
奴卡菌
弱抗酸染色
耶氏肺孢子菌
六胺银染色
细胞壁缺陷菌
吖啶橙染色
乳酸酚棉蓝染色
✓ 在玻片上滴加1滴乳酸酚棉蓝染液 ✓ 剪一段约1cm长的透明胶带，将一端贴在棉拭子木棒的一端，形成旗
帜样 ✓ 将胶带粘性一面按在菌落表面，将菌丝粘在胶带上并平放进入染液，
取下木棒，再胶带表面再滴加一滴染液，盖上盖玻片 ✓ 使用显微镜在低倍镜、高倍镜或油镜下观察真菌形态
科兹洛夫斯基染色
关注微生物报告时效性问题
操作最简单 费用最低 用时最短 结果最直观
标本直接涂片 显微镜检测
可在第一时间向临床报告镜下所见，医生根据镜检结果可作初步诊断，并以 此进行针对性用药。
主要内容
标本涂片制作方法 常用染色方法及技巧 如何阅片
标本涂片制作方法
痰液： 棉签挑取干酪样或脓性痰部分，均匀涂抹成卵圆形痰 膜（约2cm长），每张玻片只涂一份标本
墨汁染色
✓ 标本（脑脊液）离心取沉淀涂片 ✓ 在标本涂片处滴加1滴墨汁，加盖玻片 ✓ 在低倍镜下找有荚膜的菌细胞，转高倍或油镜确认 ✓ 结果：新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，细胞壁明显，有时有出芽现
象，背景黑色
注意事项
✓ 脑脊液与墨汁的最适比例，墨汁太多影响观察 ✓ 脑脊液离心后涂片，离心10-30min ✓ 痰液、支气管灌洗液均可作为隐球菌的检测标本，防止漏检
养时间过长，革兰阳性菌可能染成阴性。18—24小时为宜。 某些菌存在染色困难，不易脱色的情况，出现染色不均，阴阳不定
（某些G+b、鲍曼不动杆菌等）。 注意生物安全，自我防护。
抗酸染色
涂片固定 染色
同革兰染色
石碳酸复红 ≥10min 酸性酒精 1-2min 亚甲基蓝 30s
水洗 甩干 水洗 甩干 （必要时可重复） 水洗 待干
细菌形态学检查及质量保证
两个分隔的世界
微生物人员的无奈
标本采集不合格 有些病原菌难以生长或生长周期长 不是所有细菌都能做药敏试验 不是所有培养出的细菌都是致病菌 没有培养出细菌不代表没有感染 不是所有细菌或所有药物都有判断标
准 临床医生不主动联系试验室人员
临床医生的抱怨
苛养菌检出率低 结果重复性差 报告速度慢 感染菌与污染菌不易区分 药敏结果与治疗反应存在差
革兰染色
涂片固定 待涂片干后加热固定，火焰固定时菌膜朝上，以中
等速度通过火焰3此即可（温度不宜过高，以防菌体蛋白
染色 镜检
变性，影响染色结果），也可用乙醇或甲醇固定。
龙胆紫 10s 水洗 甩干 碘液 10s 水洗 甩干 脱色液 10-20s 水洗 甩干 沙黄 10s 水洗 待干
油镜下观察，紫色→革兰氏阳性 红色→革兰氏阴性
✓ 涂片，可混合大肠杆菌做对比，干燥、固定 ✓ 滴加2%沙黄水溶液，略加热，使之冒蒸汽，约30s—1min
后水洗 ✓ 1%孔雀绿染液复染2—3min，也可用碱性美蓝染色1—2min ✓ 吸水纸吸干后镜检
✓ 结果 布氏杆菌呈淡红色球杆菌，其它菌或细胞呈绿色
或蓝色
六胺银染色
✓ 涂片固定 ✓ 染色 1%高碘酸，氧化10min，流水冲洗
首先判断标本合格与否
开放性标本（痰液、尿液、伤口标本等） 肉眼观察（痰液粘稠、脓性、血性） 根据镜下细胞种类，数量及细菌种类判断 上皮细胞多，炎症细胞少，多不合格
强烈提示感染的镜下现象
吞噬现象
包括中性粒细胞的非特异性吞噬和巨噬细胞的特异性吞噬，与粘
附区别
包裹现象
有些病原微生物自身具有抗吞噬能力（荚膜），炎性细胞不能将 其吞噬，而是包裹起来，形成脓球
2%铁明矾 10min,流水冲洗 玻片放入60℃预热20min的工作液中40min左右，每5min观察 一次，至涂片呈淡褐色，流水冲洗
0.2%氯化金调色3—5min，流水冲洗 2%硫代硫酸钠固定3min，流水冲洗 置60℃烤箱内烤干，封片 结果 油镜下肺囊虫包囊呈圆形、卵圆形或不规则形，包囊呈黑色
质量控制
伴行现象
未被炎性细胞包裹的病原菌分布在炎性细胞周围，需与污染菌鉴别
建议
对大家公认有临床致病意义的细菌：结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌 、奴卡菌、白喉棒状杆菌、隐球菌等一经检出应立刻报临床。
对来自无菌部位的标本并排除污染的镜下细菌一经检出立刻报临床。 呼吸道及其他污染部位的条件致病菌（肺炎链球菌、嗜血杆菌、卡他