PCR技术在中药鉴定中的应用
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Байду номын сангаас
【 摘要 】 中药作 为我 国的传统 药物 ，千百年 来 ，在预 防与 治疗疾病方 面发挥 了不可替代 的作 用。但即便
是 同一种 中药材 ，在 不 同的产地 、不 同的 生长模 式等方面下都会表现 出质量 以及 药效的差异 ，而它们的性状 也许只有微 乎其微 的差别 ，这就 为中药材 鉴别方法带来 了新 的挑 战。本文仅对各种基 于Ｐ ｃ Ｒ 技 术的分子生物
２ ０ １ ７ 年第４ 卷第 ２ ４ 期
２ ０ｌ ７ Ｖｌ ０ １ ． ４ Ｎｏ ． ２ ４
临床医药文献杂志
Ｊ ｏ ｕ ｍａ ｌ ｏ ｆ Ｃｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ４７ ３ｌ
Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 在 中药 鉴 定 中的 应用
罗达 龙 ，黄 琳 （ 梧 州 食 品 药 品 检 验 所 ，广 西 梧 州 ５ ４ ３ ０ ０ ２ ）
药材等 ）进 行代用 品、混淆 品的鉴定 。但Ｒ ＡＰ Ｄ技术 的重 复 ４ 展 望 性和稳定性 差，使其在应用 上也受到 了限制［ ２ 】 。为 了克服 随 科 技 日新 月 异 的发 展 ，分 子 生 物 学 更 是 以其 可 变 性 机 扩增 多态ＤＮＡ技术 的缺 点，有研 究采取 了提取 高质量 的 强 、研 究方 向多样 、适用 范 围广等优 势 ，在药 品检验 的领 基 因组Ｄ ＮＡ，并对Ｒ ＡＰ Ｄ反应 的条件进 行 了优化等措施 ，来 域上开始高速 地发展 ，很 多基于Ｐ Ｃ Ｒ的先进技术 已经开始进 保 证其 稳定 性 。通 过对 湖北麦 冬 、川麦 冬及浙 麦冬三 种药 入 到 中药材 的鉴别 中 。当然 ，我们还 需要 致力于解 决文 中 用麦 冬基因组Ｄ ＮＡ的ＲＡ Ｐ Ｄ分析 ，筛选 出三 种麦冬的特异性 提到的不足之处 ，让Ｐ Ｃ Ｒ 技术 能成为 快速 、准 确、稳定的药 分 子 鉴 定 标 记 ，经 过 对 特 异 性 标 记 的 克 隆 和 测 序 ，最 后 设 品检 定技 术。 ’ 计 出三种 麦冬的特异性Ｐ ｃ Ｒ引物，实现 了特异性鉴定 。
２ 基于Ｐ Ｃ Ｒ 技术 的分子生物鉴定技术
２ ． １ Ｐ Ｃ Ｒ－ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ 技 术
聚合酶链 式反应． 限制性 内切酶 长度多态性技术 （ Ｐ Ｃ Ｒ — 增 出的ＤＮＡ指纹 图谱 之 间有 明显差异 ，可见Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ 技术 可作 ＲＦ Ｌ Ｐ），不仅 可 以实 现种 属 的鉴 别 ，还 能根 据 药材 的 市 为鉴别 广西 产鸡血 藤与 其混伪 品 的有 效手 段 ，为 广西产 鸡 场 特 性 ，进行 掺伪 程度 的 半定量 检测 。张文娟 等人 …的研 血藤提 供 了分子水 平 的鉴别依 据 。并通过 实验发 现在检 测 究中 ，为 避免 不法分子 将伪 品混入到川 Ｉ 贝母 中，运用Ｐ Ｃ Ｒ ． 出的遗传变异灵敏度上Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ 技术高 于Ｒ ＡＰ Ｄ 技 术，Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ技术 ＲＦ Ｌ Ｐ 技 术 探索 出检 测 川 Ｉ 贝母样 品 中掺 伪 比例 的半 定 量方 更适 用于广西产不同居群鸡血藤的遗传多样性分析。 法 。他们 从川 贝母粉 中提取ＤＮＡ，按 照体积 比 ，加 入不 同
２ ． ４ Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ技 术
１ Ｐ Ｃ Ｒ 技术概述
聚合酶链式反应 （ Ｐ Ｃ Ｒ）技术 是一种用于扩增特 定Ｄ ＮＡ
Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ技 术 又被 称 之 为锚 定 简 单序 列 重 复技 术 ， 具有
片段 的分子生物 学技术 ，Ｐ Ｃ Ｒ 技术 的最大特 点是能够将微量 重 复性好 、多态 性高等 特 点，属 于近几 年来发 展起来 的一 Ｄ ＮＡ 有效增加 ，无论是应用于古生物化石 、历史人物残骸， 类新 型 的分 子标 记技术 ，在 中药材 鉴定 方面得 到广泛 的应 Ｓ Ｓ Ｒ技 术 用 锚 定 的 微 卫 星 ＤＮＡ为 引 物 ， 在 Ｐ ＣＲ技 术 还是应用于中药材中，只要能够从中分离出一点Ｄ ＮＡ，便能 用 。 Ｉ 利用Ｐ Ｃ 贼 术对分离出Ｄ ＮＡ 增大 ，从而用于 比对 。 中，锚定 引物可 以 引起 特定 位点退 火 ，从而使 与锚定 引物 互补 间隔不 太大 的重复序 列 间Ｄ ＮＡ片段进 行Ｐ ＣＲ 扩增 。例 如 ，采用Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ技术鉴 别鸡 血藤及其混伪 品，通过筛选 出５ 条 Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ随机 引物 ，对 广西 产鸡血 藤与其混 伪 品进 行扩增 ，扩
技 术在 中药材鉴定 中的应 用作一综述 【 关键词 】Ｐ Ｃ Ｒ ＠ ￣ 术 ； 中药鉴 定 ；分子生物技 术 【 中图分类号 】Ｒ ２ ． ０ ３ 【 文献标识码 】Ａ
【 文章编号 】Ｉ Ｓ Ｓ Ｎ． ２ ０ ９ ５ ８ ２ ４ ２ ． ２ ０ １ ７ ． ２ ４ ． ４ ７ ３ １ ． ０ １
Ｐ Ｃ Ｒ 技术鉴定方法的不足 比例的伪品Ｄ ＮＡ作为模板使用 ，运用Ｐ Ｃ Ｒ－ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ 技术 ，并在 ３ （ １ ）一 些 中药 材 可 能 存在 次 生代 谢 产 物 影 响 ＤＮＡ 凝 胶 电泳后通 过软 件分析 条带 强弱 来计算 掺伪 量，从 而直
观地 了解 中药中掺假、掺伪的大概 比例 。 ２ ． ２ Ｒ ＡＰ Ｄ或ＡＰ － Ｐ Ｃ Ｒ技术 提 取 ， 或者 经 过炮 制 的 中药 材 会对 Ｄ ＮＡ提 取 造成 干 扰 ； （ ２ ）分子 生物看不 见摸不着 ，使 得在做方法 可行性试验 时 Ｒ ＡＰ Ｄ与ＡＰ － Ｐ Ｃ Ｒ是 同时发 展起 来 的ＤＮＡ分子 标记 技 需进行大 量 的实验来 摸索 与优化 ，并 需要较 强的专业 技术 （ ３ ） 中药材 种植 方法 、产地 、栽 培变 异 等 因素不 术 ，其 中 ，Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 技 术是一种对整个 未知序列基 因组进 行多 能力 ； 态 性分析 的技 术 ，该技术 应用 随机 引物 扩增 寻找 到 的多态 同，影 响每种标 记方 法 的重 现性 与稳 定性 ，实际应 用 时 需 （ ４ ）药鉴定 的发展趋势是 寻找高效 、 性ＤＮ Ａ片段 作为分子 标记 ，具有操 作简单 快捷 、灵敏 、通 要大 量样 品来验证 ； 用性好 等特 点，能够准确 检测 出Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ 标记不 能检测 的重 复 便捷 、准确 的鉴 定方 法 ，但 一般 的分子 标记鉴 别方法 仍 需 ＣＲ 扩 增 、电泳检测 三个步骤 ，时 顺序 ，填Ｓ ｂ ＲＦ Ｌ Ｐ 的 图谱 空缺 。将 Ｒ ＡＰ Ｄ技 术应用 于 中药 鉴 经过 药材ＤＮＡ的提 取、Ｐ 定 中，其 主要是 对 中药生 药材 （ 如动物 类生 药材 、名贵 生 间还 是 长 于 其 他 鉴 别 方 法 。
【 摘要 】 中药作 为我 国的传统 药物 ，千百年 来 ，在预 防与 治疗疾病方 面发挥 了不可替代 的作 用。但即便
是 同一种 中药材 ，在 不 同的产地 、不 同的 生长模 式等方面下都会表现 出质量 以及 药效的差异 ，而它们的性状 也许只有微 乎其微 的差别 ，这就 为中药材 鉴别方法带来 了新 的挑 战。本文仅对各种基 于Ｐ ｃ Ｒ 技 术的分子生物
２ ０ １ ７ 年第４ 卷第 ２ ４ 期
２ ０ｌ ７ Ｖｌ ０ １ ． ４ Ｎｏ ． ２ ４
临床医药文献杂志
Ｊ ｏ ｕ ｍａ ｌ ｏ ｆ Ｃｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ４７ ３ｌ
Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 在 中药 鉴 定 中的 应用
罗达 龙 ，黄 琳 （ 梧 州 食 品 药 品 检 验 所 ，广 西 梧 州 ５ ４ ３ ０ ０ ２ ）
药材等 ）进 行代用 品、混淆 品的鉴定 。但Ｒ ＡＰ Ｄ技术 的重 复 ４ 展 望 性和稳定性 差，使其在应用 上也受到 了限制［ ２ 】 。为 了克服 随 科 技 日新 月 异 的发 展 ，分 子 生 物 学 更 是 以其 可 变 性 机 扩增 多态ＤＮＡ技术 的缺 点，有研 究采取 了提取 高质量 的 强 、研 究方 向多样 、适用 范 围广等优 势 ，在药 品检验 的领 基 因组Ｄ ＮＡ，并对Ｒ ＡＰ Ｄ反应 的条件进 行 了优化等措施 ，来 域上开始高速 地发展 ，很 多基于Ｐ Ｃ Ｒ的先进技术 已经开始进 保 证其 稳定 性 。通 过对 湖北麦 冬 、川麦 冬及浙 麦冬三 种药 入 到 中药材 的鉴别 中 。当然 ，我们还 需要 致力于解 决文 中 用麦 冬基因组Ｄ ＮＡ的ＲＡ Ｐ Ｄ分析 ，筛选 出三 种麦冬的特异性 提到的不足之处 ，让Ｐ Ｃ Ｒ 技术 能成为 快速 、准 确、稳定的药 分 子 鉴 定 标 记 ，经 过 对 特 异 性 标 记 的 克 隆 和 测 序 ，最 后 设 品检 定技 术。 ’ 计 出三种 麦冬的特异性Ｐ ｃ Ｒ引物，实现 了特异性鉴定 。
２ 基于Ｐ Ｃ Ｒ 技术 的分子生物鉴定技术
２ ． １ Ｐ Ｃ Ｒ－ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ 技 术
聚合酶链 式反应． 限制性 内切酶 长度多态性技术 （ Ｐ Ｃ Ｒ — 增 出的ＤＮＡ指纹 图谱 之 间有 明显差异 ，可见Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ 技术 可作 ＲＦ Ｌ Ｐ），不仅 可 以实 现种 属 的鉴 别 ，还 能根 据 药材 的 市 为鉴别 广西 产鸡血 藤与 其混伪 品 的有 效手 段 ，为 广西产 鸡 场 特 性 ，进行 掺伪 程度 的 半定量 检测 。张文娟 等人 …的研 血藤提 供 了分子水 平 的鉴别依 据 。并通过 实验发 现在检 测 究中 ，为 避免 不法分子 将伪 品混入到川 Ｉ 贝母 中，运用Ｐ Ｃ Ｒ ． 出的遗传变异灵敏度上Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ 技术高 于Ｒ ＡＰ Ｄ 技 术，Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ技术 ＲＦ Ｌ Ｐ 技 术 探索 出检 测 川 Ｉ 贝母样 品 中掺 伪 比例 的半 定 量方 更适 用于广西产不同居群鸡血藤的遗传多样性分析。 法 。他们 从川 贝母粉 中提取ＤＮＡ，按 照体积 比 ，加 入不 同
２ ． ４ Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ技 术
１ Ｐ Ｃ Ｒ 技术概述
聚合酶链式反应 （ Ｐ Ｃ Ｒ）技术 是一种用于扩增特 定Ｄ ＮＡ
Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ技 术 又被 称 之 为锚 定 简 单序 列 重 复技 术 ， 具有
片段 的分子生物 学技术 ，Ｐ Ｃ Ｒ 技术 的最大特 点是能够将微量 重 复性好 、多态 性高等 特 点，属 于近几 年来发 展起来 的一 Ｄ ＮＡ 有效增加 ，无论是应用于古生物化石 、历史人物残骸， 类新 型 的分 子标 记技术 ，在 中药材 鉴定 方面得 到广泛 的应 Ｓ Ｓ Ｒ技 术 用 锚 定 的 微 卫 星 ＤＮＡ为 引 物 ， 在 Ｐ ＣＲ技 术 还是应用于中药材中，只要能够从中分离出一点Ｄ ＮＡ，便能 用 。 Ｉ 利用Ｐ Ｃ 贼 术对分离出Ｄ ＮＡ 增大 ，从而用于 比对 。 中，锚定 引物可 以 引起 特定 位点退 火 ，从而使 与锚定 引物 互补 间隔不 太大 的重复序 列 间Ｄ ＮＡ片段进 行Ｐ ＣＲ 扩增 。例 如 ，采用Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ技术鉴 别鸡 血藤及其混伪 品，通过筛选 出５ 条 Ｉ Ｓ Ｓ Ｒ随机 引物 ，对 广西 产鸡血 藤与其混 伪 品进 行扩增 ，扩
技 术在 中药材鉴定 中的应 用作一综述 【 关键词 】Ｐ Ｃ Ｒ ＠ ￣ 术 ； 中药鉴 定 ；分子生物技 术 【 中图分类号 】Ｒ ２ ． ０ ３ 【 文献标识码 】Ａ
【 文章编号 】Ｉ Ｓ Ｓ Ｎ． ２ ０ ９ ５ ８ ２ ４ ２ ． ２ ０ １ ７ ． ２ ４ ． ４ ７ ３ １ ． ０ １
Ｐ Ｃ Ｒ 技术鉴定方法的不足 比例的伪品Ｄ ＮＡ作为模板使用 ，运用Ｐ Ｃ Ｒ－ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ 技术 ，并在 ３ （ １ ）一 些 中药 材 可 能 存在 次 生代 谢 产 物 影 响 ＤＮＡ 凝 胶 电泳后通 过软 件分析 条带 强弱 来计算 掺伪 量，从 而直
观地 了解 中药中掺假、掺伪的大概 比例 。 ２ ． ２ Ｒ ＡＰ Ｄ或ＡＰ － Ｐ Ｃ Ｒ技术 提 取 ， 或者 经 过炮 制 的 中药 材 会对 Ｄ ＮＡ提 取 造成 干 扰 ； （ ２ ）分子 生物看不 见摸不着 ，使 得在做方法 可行性试验 时 Ｒ ＡＰ Ｄ与ＡＰ － Ｐ Ｃ Ｒ是 同时发 展起 来 的ＤＮＡ分子 标记 技 需进行大 量 的实验来 摸索 与优化 ，并 需要较 强的专业 技术 （ ３ ） 中药材 种植 方法 、产地 、栽 培变 异 等 因素不 术 ，其 中 ，Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 技 术是一种对整个 未知序列基 因组进 行多 能力 ； 态 性分析 的技 术 ，该技术 应用 随机 引物 扩增 寻找 到 的多态 同，影 响每种标 记方 法 的重 现性 与稳 定性 ，实际应 用 时 需 （ ４ ）药鉴定 的发展趋势是 寻找高效 、 性ＤＮ Ａ片段 作为分子 标记 ，具有操 作简单 快捷 、灵敏 、通 要大 量样 品来验证 ； 用性好 等特 点，能够准确 检测 出Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ 标记不 能检测 的重 复 便捷 、准确 的鉴 定方 法 ，但 一般 的分子 标记鉴 别方法 仍 需 ＣＲ 扩 增 、电泳检测 三个步骤 ，时 顺序 ，填Ｓ ｂ ＲＦ Ｌ Ｐ 的 图谱 空缺 。将 Ｒ ＡＰ Ｄ技 术应用 于 中药 鉴 经过 药材ＤＮＡ的提 取、Ｐ 定 中，其 主要是 对 中药生 药材 （ 如动物 类生 药材 、名贵 生 间还 是 长 于 其 他 鉴 别 方 法 。