基因的克隆方法ppt课件
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1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
差减杂交（SH） 抑制性差减杂交（SSH） 差异显示PCR（DD RT-PCR） DNA代表性差异分析（DNA RDA） 扩增限制性片段长度多样性（AFLP） cDNA微阵列
9
差减杂交（SH）
最早由Lamar和Palmer于1984年提出并 用于雄鼠Y染色体的DNA研究。
NO.1
超声波打断雌鼠 的DNA（过量100 倍）(XX)
目的基因
分子标记3
进一步精细定位
37
获得目的基因
通过染色体步移或染色体登陆技术对 目标基因进行进一步精细定位，得到阳 性克隆。 对阳性克隆转化隐性受体进行功能互 补。 基因序列测定及表达分析等。
38
影响基因图位克隆的因素：
✓ 建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的 距离大小。 ✓ 基因组的大小一、 基于基因产物的基因克隆方法
mRNA
翻译成 蛋白质
1、根据蛋白质序列克隆目的基因 2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因 5
1、蛋白质序列克隆法
原理：根据蛋白质上的一段多 肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列， 然后设计探针或引物从基因组 或cDNA中分离出相应的基因。
6
已发展的相应基因克隆方法：
29
1、通过分子杂交克隆法原理： 根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分
离获得的基
2、通过PCR扩增基因法原理：
根据基因序列结构特征，设计基因特 异引物，利用PCR技术直接从生物的基因 组或是cDNA中扩增出目的基因。
12
1.2.2 抑制性差减杂交（SSH）
Tester样本mRNA
Driver样本mRNA
SfiI A
SfiI B
cDNA
5`
3`
cDNA
过量
A
B
混合，变性杂交
A
B
PCR扩增
13
应用 基因突变体的研究：如基因的表达与不 表达 基因时空表达的研究：如根、茎、叶 不同处理条件下的基因表达差异：如施 肥与不施肥、光照与不光照
MboI完全消化雄鼠 的DNA (XY)
NO.2
变性、复性 去除共有序列
BamHI酶切 表达载体
NO.3
连接 10
SH在mRNA研究上的应用机理：
!! 特异表达基因
的样本（TS）
无特异表达基因的 样本（RS）
提取mRNA 转录
cDNA
杂交
提取mRNA 转录
✓ 简单转座子：可以直接插入到其他位置,也叫 插入序列。 ✓ 复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记。
结构共同点：
✓ 两端含有20-40个核苷酸的倒置重复序列。 ✓ 含有可编码转座酶的基因。
应用：以Ac/Ds系统为例
27
Ac/Ds系统操作原理
把Ac，Ds分别转化并获得转化体。 把Ac转化体同Ds转化体进行杂交得到F1
14
1.2.3 差异显示PCR（DD RT-PCR）
最先由Liang等于1992年报道，目前已广泛 在实验室使用。
主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有 POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样 引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结 合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合 5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同 长度的基因得到扩增。
25
转座子标签法
最早是美国玉米育种家1951年发现，起初不被 认同，1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实 后得到认同。 根据DNA的结构和转座的机理，分为两大家族： 转座子和逆转座子，前者如玉米的Ac/Ds系统和 spm因子，后者如果蝇的copia因子。
26
转座子根据结构不同可以分为简单转座子 和复杂转座子
cDNA 过量
去除过量的RS的cDNA及杂交分子
TS的CDNA纯化、富集、扩增
不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限。 11
差减杂交技术的应用方面：
基因突变体的研究：如基因的表达与不 表达； 基因时空表达的研究：如根、茎、叶； 不同处理条件下的基因表达差异：如施 肥与不施肥、光照与不光照。
GCTTTTTTTT
GGTTTTTTTT
16
17
具体操作： 1、提取mRNA； 2、特定引物（12分之一）反转录； 3、特定引物和RP结合RT-PCR； 4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合
分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别 DNA。
18
缺点：
假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容 易检测。
代，然后自交得到F2、F3代分离群体， 找出稳定 基于基因序列的基因克隆 方法
根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因 克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆 法和通过PCR扩增基因法
原理：主要是在生物基因组中插入 外源的一段DNA，使生物体产生 某种突变表型，然后反过来利用这 段外源已知的DNA片段来克隆基 因的方法。
21
分类： T-DNA标签法 转座子标签法。
外源DNA
基因组染色体DNA
基因A 产生突变型
22
T-DNA标签法克隆基因技术路线：
➢ 农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突 变性状的个体。
第三章 基因的克隆方法
1
前言
基因是生物染色体上的一段DNA 序列，具有转录、翻译成某种蛋白质 调控生物生命活动的功能。
2
基
基因组
因
DNA
的
mRNA
表
达
翻译成
过
蛋白质
程
3
如何获得基因？
——即基因的克隆方法
基于基因产物的基因克隆方法 基于基因加标签的基因克隆方法 基于基因序列的基因克隆方法 基于基因图谱的基因克隆方法
成功的例子：
✓ 水稻Xa21 ✓ 拟南芥的RPM1，RPS2等。
39
图位克隆基因需满足的条件： 较理想的遗传图谱和物理图谱，如传转化技术。
40
其它的基因克隆法
cDNA捕捉法 RNAi：RNA干涉法 酵母双杂交法 。。。。。。
适合扩增真核生物基因。 原核生物不易得到mRNA，也不含有 polyA尾。
33
4 、基于基因图谱的基因克 隆方法
又称图位克隆法，是建立在拥论上可以分离任何一个突变基因。
34
基因图位克隆示意图
分子标记A 染色体
目的基因
41
思考题
请简单阐述SH在mRNA水平上克隆差异表 达基因的机理。
42
分子标记B
阳性克隆
转化互补实验
35
图位克隆基因的一般操作过程：
通过遗传分析构建与目标基因紧密 连锁的分子标记连锁图，达到基因的 精细定位。
用与目标基因紧密连锁的两侧分子 标记筛选基因组，构建包含目标 基因的基因组物理图谱。
标记1 标记2
目的 基因
标记3 标记4
标记5
36
基因组物理图谱
分子标阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序
分析。
23
转基因株 目的基因
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
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AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
差减杂交（SH） 抑制性差减杂交（SSH） 差异显示PCR（DD RT-PCR） DNA代表性差异分析（DNA RDA） 扩增限制性片段长度多样性（AFLP） cDNA微阵列
9
差减杂交（SH）
最早由Lamar和Palmer于1984年提出并 用于雄鼠Y染色体的DNA研究。
NO.1
超声波打断雌鼠 的DNA（过量100 倍）(XX)
目的基因
分子标记3
进一步精细定位
37
获得目的基因
通过染色体步移或染色体登陆技术对 目标基因进行进一步精细定位，得到阳 性克隆。 对阳性克隆转化隐性受体进行功能互 补。 基因序列测定及表达分析等。
38
影响基因图位克隆的因素：
✓ 建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的 距离大小。 ✓ 基因组的大小一、 基于基因产物的基因克隆方法
mRNA
翻译成 蛋白质
1、根据蛋白质序列克隆目的基因 2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因 5
1、蛋白质序列克隆法
原理：根据蛋白质上的一段多 肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列， 然后设计探针或引物从基因组 或cDNA中分离出相应的基因。
6
已发展的相应基因克隆方法：
29
1、通过分子杂交克隆法原理： 根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分
离获得的基
2、通过PCR扩增基因法原理：
根据基因序列结构特征，设计基因特 异引物，利用PCR技术直接从生物的基因 组或是cDNA中扩增出目的基因。
12
1.2.2 抑制性差减杂交（SSH）
Tester样本mRNA
Driver样本mRNA
SfiI A
SfiI B
cDNA
5`
3`
cDNA
过量
A
B
混合，变性杂交
A
B
PCR扩增
13
应用 基因突变体的研究：如基因的表达与不 表达 基因时空表达的研究：如根、茎、叶 不同处理条件下的基因表达差异：如施 肥与不施肥、光照与不光照
MboI完全消化雄鼠 的DNA (XY)
NO.2
变性、复性 去除共有序列
BamHI酶切 表达载体
NO.3
连接 10
SH在mRNA研究上的应用机理：
!! 特异表达基因
的样本（TS）
无特异表达基因的 样本（RS）
提取mRNA 转录
cDNA
杂交
提取mRNA 转录
✓ 简单转座子：可以直接插入到其他位置,也叫 插入序列。 ✓ 复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记。
结构共同点：
✓ 两端含有20-40个核苷酸的倒置重复序列。 ✓ 含有可编码转座酶的基因。
应用：以Ac/Ds系统为例
27
Ac/Ds系统操作原理
把Ac，Ds分别转化并获得转化体。 把Ac转化体同Ds转化体进行杂交得到F1
14
1.2.3 差异显示PCR（DD RT-PCR）
最先由Liang等于1992年报道，目前已广泛 在实验室使用。
主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有 POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样 引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结 合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合 5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同 长度的基因得到扩增。
25
转座子标签法
最早是美国玉米育种家1951年发现，起初不被 认同，1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实 后得到认同。 根据DNA的结构和转座的机理，分为两大家族： 转座子和逆转座子，前者如玉米的Ac/Ds系统和 spm因子，后者如果蝇的copia因子。
26
转座子根据结构不同可以分为简单转座子 和复杂转座子
cDNA 过量
去除过量的RS的cDNA及杂交分子
TS的CDNA纯化、富集、扩增
不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限。 11
差减杂交技术的应用方面：
基因突变体的研究：如基因的表达与不 表达； 基因时空表达的研究：如根、茎、叶； 不同处理条件下的基因表达差异：如施 肥与不施肥、光照与不光照。
GCTTTTTTTT
GGTTTTTTTT
16
17
具体操作： 1、提取mRNA； 2、特定引物（12分之一）反转录； 3、特定引物和RP结合RT-PCR； 4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合
分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别 DNA。
18
缺点：
假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容 易检测。
代，然后自交得到F2、F3代分离群体， 找出稳定 基于基因序列的基因克隆 方法
根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因 克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆 法和通过PCR扩增基因法
原理：主要是在生物基因组中插入 外源的一段DNA，使生物体产生 某种突变表型，然后反过来利用这 段外源已知的DNA片段来克隆基 因的方法。
21
分类： T-DNA标签法 转座子标签法。
外源DNA
基因组染色体DNA
基因A 产生突变型
22
T-DNA标签法克隆基因技术路线：
➢ 农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突 变性状的个体。
第三章 基因的克隆方法
1
前言
基因是生物染色体上的一段DNA 序列，具有转录、翻译成某种蛋白质 调控生物生命活动的功能。
2
基
基因组
因
DNA
的
mRNA
表
达
翻译成
过
蛋白质
程
3
如何获得基因？
——即基因的克隆方法
基于基因产物的基因克隆方法 基于基因加标签的基因克隆方法 基于基因序列的基因克隆方法 基于基因图谱的基因克隆方法
成功的例子：
✓ 水稻Xa21 ✓ 拟南芥的RPM1，RPS2等。
39
图位克隆基因需满足的条件： 较理想的遗传图谱和物理图谱，如传转化技术。
40
其它的基因克隆法
cDNA捕捉法 RNAi：RNA干涉法 酵母双杂交法 。。。。。。
适合扩增真核生物基因。 原核生物不易得到mRNA，也不含有 polyA尾。
33
4 、基于基因图谱的基因克 隆方法
又称图位克隆法，是建立在拥论上可以分离任何一个突变基因。
34
基因图位克隆示意图
分子标记A 染色体
目的基因
41
思考题
请简单阐述SH在mRNA水平上克隆差异表 达基因的机理。
42
分子标记B
阳性克隆
转化互补实验
35
图位克隆基因的一般操作过程：
通过遗传分析构建与目标基因紧密 连锁的分子标记连锁图，达到基因的 精细定位。
用与目标基因紧密连锁的两侧分子 标记筛选基因组，构建包含目标 基因的基因组物理图谱。
标记1 标记2
目的 基因
标记3 标记4
标记5
36
基因组物理图谱
分子标阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序
分析。
23
转基因株 目的基因