关中奶山羊细管冷冻精液制作与受孕试验

2023年第03期
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D O I:10.3969/J.I SSN.1671-6027.2023.03.005
动物精液冷冻保存可延长精子存活时间,使精子授精不受时间、地域及动物身体条件的限制,提高了种畜利用率,加快了品种遗传改良速度,在优良畜禽种质资源保护利用方面有重要意义。

在羊冷冻精液研究初期,研究者借鉴参考了牛冷冻精液的冷冻方法和冻保护剂。

1950年Sm i t h和Pol ge首次将山羊精子冷冻保存。

研究中发现,发现经冷冻保存后的精子品质受众多因素影响,包括冷冻稀释液、抗冻剂、冷冻速率、解冻速率等物理化学因素。

如何提高奶山羊精子冷冻-解冻后的品质,成为目前研究的重点。

因此,根据奶山羊精液和精子的生理特点,筛选合适的冷冻保护剂、改进冷冻方法可改善奶山羊精液冷冻保存效果,提高冷冻后精液的品质和授精能力。

关中奶山羊陕西省优良的地方品种,主要产于陕西关中地区,关中奶山羊以产奶为主,产奶性能稳定,产奶量高,羊奶营养价值较高。

建立一种关中奶山羊精液冷冻制作方法,对提高优秀种公羊利用
率,加快关中奶山羊的选育进程,促进陕西奶山羊产业的发展都具有重要意义。

1
材料与方法
(1)试验用种公羊由阎良区建仁种羊场和富平莫瑞斯种业科技有限公司提供,选择2~4岁体质健康、性欲旺盛的种公羊。

在临潼区绿苜奶山羊养殖场开展冷冻精液和鲜精人工受孕试验,分别在秋季(2021年9月、2022年9月)和春季(2022年5月)进行同期发情人工授精试验。

(2)试验试剂柠檬酸钠、葡萄糖、乳糖、甘油、
大豆卵磷脂、V
B12、新鲜无污染鸡蛋,双蒸水、前列腺素(PG,宁波三生)、孕马血清促性腺激素(PM SG)、硅胶羊阴道栓塞(国产)。

(3)试验仪器设备相差显微镜及精子质量分析系统(I M V)、全自动精子密度仪(M i ni t ube)、智能型细管冻精四头封装打印一体机(M i ni t ube)、低温平衡柜(M i ni t ube)、低温液氮罐、磁力加热搅拌器、
关中奶山羊细管冷冻精液制作与受孕试验
卫利选1,曹平1★,贾志宏1,梁小贤2,贺周争雁1,
肖欢1,张力妮1,李龙1,罗茜1
(1.西安市畜牧技术推广中心,陕西西安710000;2.西安市灞桥区动物疫病预防控制中心,陕西西安710000)
摘要:本试验研究了关中奶山羊细管冷冻精液的冷冻稀释液配方的筛选,并采用同期发情技术处理进行细管冷冻精液人工授精试验,结果显示,第3组冷冻稀释液对关中奶山羊精液冷冻效果最佳(P<0.05);在关中奶山羊细管冷冻精液人工授精试验中,秋季的同期处理发情率90%以上,细管冷冻精液配种受胎率72.2%,均显著影高于春季(P<0.05)。

关键词:关中奶山羊;冷冻精液;冷冻稀释液;同期发情;人工授精
作者简介:卫利选(1984~),陕西扶风人,硕士,畜牧师,主要从事遗传育种与繁殖工作。

★通信作者:曹平(1963~),陕西渭南人,硕士,高级兽医师,主要从事种公牛育种工作。

资助项目:西安市科技计划项目关中奶山羊冷冻精液制备与示范应用(20N Y Y F0033)。

试验研究
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超声波清洗器、数显电热恒温水箱、低温液体贮槽、液氮生物容器、手提式压力蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱、电子天平、冰箱、纯水仪、移液器等。

1.2.1冷冻稀释液用天平准确称取葡萄糖3.1g 、乳糖4.6g 、柠檬酸钠1.5g 用100m L 双蒸水溶解,加入双抗。

Ⅰ液:取基础液85m L 加新鲜卵黄15m L 。

Ⅱ液:在Ⅰ液中添加适当量甘油。

本试验共分5组,其中甘油添加量分4.0%、5.0%、6.0%三组,用2.0%大豆卵磷脂替换卵黄一组,添加V B12对照一组,各组成分(见表1)。

表1
冷冻稀释液成分表
1.2.2鲜精检测采用假阴道方法采精,鲜精没有
异味,乳白色或淡黄色,在相差显微镜下用卡苏公司精子质量分析系统镜检,精子形态正常,精子畸形率≤10%,精子密度≥6×109个/m L ,精子活力≥70%以上可用于制作细管冻精。

1.2.3精液稀释平衡将镜检合格的鲜精依据采精量、精子活力、精子密度计算稀释倍数及冷冻稀释液需要量,采用两步稀释法,先加入Ⅰ液进行稀释,然后将稀释后的精液与Ⅱ液放在5℃低温平衡柜平衡1h ,1h 后加入等量的Ⅱ液进行稀释,稀释均匀后继续置于5℃平衡2h 。

所有稀释均在等温条件下进行。

1.2.4细管冻精封装5℃低温平衡完成后,利用智能型细管冻精四头封装打印一体机(M i ni t ube )分装并封口,细管规格0.25m L ,冻精细管上打印生产地、种公羊号、生产日期等信息。

封装完成后,继续5℃低温平衡5m i n ,采用液氮熏蒸冷冻方法进行冷冻。

1.2.5冷冻方案液氮熏蒸冷冻方法是将低温平衡后的细管均匀摆在细管架上,将细管架放入液氮槽中,冻精细管距离液氮面5cm 左右,盖上盖子熏蒸
3~5m i n ,熏蒸完成后,将细管投入液氮中,完成冷冻。

1.2.6同期发情处理及配种方案选择2~3岁、膘情良好、无繁殖疾病且体况良好的关中奶山羊母羊。

在试验开始的第一天早上,清洁母羊外阴部并用生理盐水棉球擦拭干净,利用放栓器将国产硅胶栓缓缓放入母羊阴道内,放栓时不能损伤阴道粘膜,防止出血和引发炎症,第13天撤出硅胶栓,肌注PG 0.1m g+PM SG 350I U 。

观察母羊发情表现,在出现发情表现后12h 第一次输精,间隔12h 第二次输精,一般根据母羊发情表现输精2~3次。

总共分三组,第一二组使用细管冷冻精液配种,第三组使用鲜精配种作为对照组。

本试验应用M i cr os of t Ex-cel 2016进行数据统计整理。

采用SPSS22.0软件进
行单因素方差分析,用“平均值±标准差”表示,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2
结
果
从表2可
知,6%甘油15%卵黄组的精子活力和顶体完整性显著高于其他处理组(P <0.05),添加V B12影响不大(P >0.05);2.0%的大豆卵磷脂替代卵黄组的活力和顶体完整性明显低于6%甘油15%卵黄组。

从表3可知,母羊经同期发情处理后进行人工输精,秋季对照组的同期处理发情率100%,鲜精人工授精受胎率77.5%。

试验一组同期发情处理发情率90%、受胎率72.2%;试验二组同期发情处理发情率78.9%、受胎率63.3%。

春秋季差异明显,秋季发情率和受胎率明显高于春季。

3小结与讨论
在动物精液冷冻保存过程中,
冷冻保护剂是精
表2
不同冷冻稀释液对精子冻后品质影响
注:同列数据上所标字母不同代表差异显著(P <0.05),字母相同表示差异不显著(P >0.05)。

表3
同期发情处理及冻精输配效果
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液冷冻保存的关键因子。

冷冻保护剂有渗透性保护
剂和非渗透性保护剂,常用的渗透性保护剂有甘油、二甲基亚砜、乙二醇等,常见的非渗透性保护剂有卵黄、糖类等。

甘油是精子最佳冷冻保护剂,可有效提升精子冻后质量和运动性。

杨素芳等发现,冷冻稀释液中添加6%左右的甘油,精子冻后品质显著优于其他添加量。

研究显示,在冷冻稀释液中通常添加甘油和卵黄共同作为保护剂,卵黄不仅可以防止精子受到冷休克,还可以给精子提供营养。

在常温条件下,甘油对精子有一定的毒害作用,因此,学者在稀释方法上不断优化,采用两步稀释方法,低温时加甘油可以减少对精子的毒副作用。

同时,研究发现两步稀释法冷冻的精子解冻后品质优于一步稀释法。

冷冻方法对精子冷冻效果影响显著,采用常规的液氮熏蒸法冷冻时,细管距离液氮面的高度和熏蒸时间对精子冻后品质影响明显。

保国俊研究表明,山羊冻精细管位于液氨面上方2cm处熏蒸7 m i n冷冻效果最佳,精子冻后活力为42.33%。

一般认为,细管置于液氮面上4~5cm熏蒸4~10m i n都可以,本试验采用的是细管距液氮面5cm左右,熏蒸3~5m i n。

在冷冻稀释液添加其他的添加剂,可有效提高精子冻后品质。

周占琴等研究发现,在羊精子稀释液中添加V
B12
可以延长精子在室温下存活时间,也可提高精子冻后活力、存活时间和受胎率。

饶静研
究显示,稀释液中添加V
B12
可以提高精子冻后质量,延长精子存活时间,提高受胎率。

而在本试验中发
现,稀释液中添加V
B12
与否对精子的冻后品质影响不明显。

在冷冻稀释液组分、稀释方法、冷冻方法等方面做了大量的研究,在各种条件下,羊精液冷冻保存效果在很大程度上取决于原精质量的优劣。

关中奶山羊是季节性发情动物,主要发情季在秋冬季。

季节对同期发情技术的发情受胎效果影响报道较多,宫旭胤等研究发现,经同期发情处理的母羊,冬季的发情率为90.9%显著高于春季的发情率75.0%,冬季繁殖率达到100.0%显著高于春季的繁殖率82.0%。

王旭光等研究显示,在秋季使用同期发情方法处理后,母羊发情率、受胎率及产羔率分别为93.1%、89.4%和96.3%,均显著高于春季处理母羊的发情率(78.9%)、受胎率(75.5%)及产羔率(67.5%)。

本试验关中奶山羊秋季同期发情处理发情率90%以上显著高于春季发情率78.9%,秋季冷冻精液配种受胎率72.2%显著高于春季63.3%,与其他学者的研究结果基本一致,但是,秋季鲜精输精配种受胎率77.5%明显高于冷冻精液输精受胎率,这可能与关中奶山羊季节性发情有极大关系。

因此,进一步优化关中奶山羊冷冻精液制作的冷冻稀释液和冷冻方法,提高冷冻精液冻后品质及受胎效果,同时提升非繁殖季节关中奶山羊的同期发情效率,可提升母羊繁殖效率,达到两年三产,便于集约化生产,降低工作强度,提高生产效益。

在关中奶山羊细管冻精制作过程中,第3组冷冻稀释液的效果最佳,冷冻稀释液中添加6%甘油和15%新鲜卵黄可有效提高精子冻后活力和顶体完整性。

在关中奶山羊冷冻精液人工授精试验中,秋季的同期处理发情率90%以上,细管冷冻精液人工授精受胎率72.2%,均显著高于春季。

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