7植物基因组DNA提取-CTAB法
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离心的作用有哪些？ 用乙醇沉淀DNA时，为什么要加入单价阳离子
（NaAc或KAc）？ 为什么用70%乙醇清洗DNA沉淀而不是无水乙醇？
1. 2% CTAB抽提缓冲液
CTAB 2g， NaCl 8.18g ， EDTA-Na2-2H2O 0.74g， 10ml 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 先用 70ml ddH2O溶解, 再定容至100ml，灭菌, 冷却后 加入0.2% β-巯基乙醇0.2ml。
终浓度： CTAB 2%, NaCl 1.4mol/L（生理平衡 作用）, EDTA20mmol/L(螯合离子作用)，β-巯基 乙醇 100 mmol/L或PVP（聚乙烯吡咯烷酮 ）（降 低氧化酶类的活性，防止酚氧化成醌，有效去除 多酚。）
7.用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后，溶于适量的 灭菌ddH2O或TE缓冲液中。
注意事项
1）选取新鲜、幼嫩的பைடு நூலகம்料，避免研磨困难、材料含 有较多的多酚类物质、提取产物有颜色等；
2）研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液 充分混匀；
3）为获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过 程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地 搅拌，防止热变性，还要避免核酸降解酶的降解。
（二）获取程序及原理
1. 破壁破膜，释放染色体
利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；然后 加入CTAB缓冲液。
有效制备DNA时要考虑两个原则： 防止和抑制内源 DNase 对 DNA的降解； 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程 中DNase无法活动。
四、实验方法与步骤
1 .准备：2%CTAB 抽提缓冲液在65℃水浴中预热
2. 破碎细胞：取少量叶片（约1g）置于研钵中，倒 入液氮尽快研磨至粉状
3. 破膜、释放核蛋白：将3ml预热的CTAB缓冲液加 入10ml的离心管中，再将研磨的粉末用药匙转 移到离心管，充分混匀，65℃水浴中10 min ， 每隔几分钟 ，轻轻摇动（目的：65℃下染色体 充分释放）
2. 氯仿-异戊醇（24:1）：先加96ml氯仿，
再加4ml异戊醇，摇匀即可。
3. 1mol/LTris-HCl (pH8.0) 500ml：称取
60.57g Tris，用盐酸调至pH8.0，具有缓冲酸碱 度变化的作用。
4. TE 缓 冲 液 ： 10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)
+ 1mmol/L EDTA
高等植物总DNA提取
—— CTAB法AB法
实验类型：验证型
一、实验目的与要求
掌握CTAB法抽提植物DNA的基本原理。 学习并掌握CTAB法抽提植物DNA的技术和方法。
二、实验原理
（一）植物细胞中DNA在哪里？怎样获得？
➢ 植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为 核DNA、染色体DNA、核基因组DNA，细胞质中 也有少量DNA，主要分布在线粒体、叶绿体内，称 为核外DNA。 ➢ 细胞内的各种DNA称为总DNA。 ➢ 程序：破壁破膜→去蛋白质→沉淀DNA
复习题（判断）
将DNA提取液65度温育20分钟，可以灭活DNase。 （）
在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚， 说明其中蛋白质含量较高，可增加氯仿/异戊醇 抽提的次数或适当延长离心的时间。（ ）
DNA提取过程中避免剧烈震荡。（ ）
清洗DNA沉淀用的是无水乙醇。（ ）
复习题（简答）
复习题（填空）
TE的中文名是三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四 乙酸。
CTAB的作用主要是：溶解细胞膜，与核酸形成 复合物。
EDTA的作用主要是：螯合离子。 巯基乙醇 的作用主要是：降低氧化酶类的活性。
CTAB法提取DNA的一般程序是：破壁破膜、去 蛋白质、沉淀DNA。
Tris-HCl的作用：缓冲液，维持溶液pH值在8.0左 右，防止过酸、过碱破坏核酸。
3. 沉淀DNA
用异丙醇或乙醇沉淀DNA ，而 CTAB 因 溶于乙醇或异丙醇而被除去。
三、实验材料与器具
实验材料：大头菜的新鲜嫩叶 实验仪器：水浴锅、台式离心机、冰箱 实验器具：移液器、离心管、吸头、研钵和杵子、
液氮罐 实验药品：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、
Tris（三羟基甲基氨基甲烷）、EDTA(乙二胺四乙 酸)、氯仿、异戊醇、液氮、无水乙醇等
4.沉淀蛋白质及多糖杂质：8000r/m离心10min。
5.抽提除去蛋白质等杂质：将上清液转移到另一个 离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，混匀后， 12000r/m离心5 min。
6.沉淀DNA：用移液枪将上层水相吸入另一离心管 中，加2/3体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇， 轻轻混匀，于4℃下放置10 min或-20 ℃放置5min ， 使得核酸沉淀下来，用8000r/m离心5 min。此时 便可以观察到是否获得DNA沉淀。
五、作业
每两人提取一份DNA，请老师验收。 撰写实验报告。 在实验结果中说明每一操作步骤后DNA
在哪儿。
复习题（解释名词术语）
核DNA 核外DNA 基因组DNA 总DNA 离心 缓冲液 螯合剂
复习题（填空）
Tris的中文名是 三羟甲基氨基甲烷 。 CTAB的中文名是十六烷基三甲基溴化铵。 DNase的中文名是脱氧核糖核酸酶。 EDTA的中文名是乙二胺四乙酸。 PVP的中文名是 聚乙烯吡咯烷酮。 r/m （rpm）的中文意思是 转每分。 KAc的中文名是 乙酸钾（醋酸钾）。
加入CTAB，cetyltrimethylammonium bromide （十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂）
破坏细胞膜，使大分子DNA释放到提取缓冲液中； 保护DNA不受内源核酸酶的降解; 由于液氮研磨
对组织破碎程度很高且均匀，当加入螯合剂（如 EDTA、柠檬酸，通常 10 -100 mM）后，DNase 所需的辅助因子 Mg2+或Mn2+尚未开始作用已被 螯合剂掩盖；从而抑制DNA酶活性。
2.去蛋白质、多糖等杂质
CTAB 与核酸能形成复合物，在高盐溶液中可溶， 通过离心就可将 CTAB - 核酸的复合物与蛋白、多 糖类物质分开。 上清液中DNA再用氯仿-异戊醇混合液抽提，震 荡使核蛋白溶液乳化，然后离心，变性的蛋白质凝 胶便停留在水相和氯仿相中间，而 DNA 溶于上层 水相，吸出上层水相便可除去DNA中的蛋白质等。
（NaAc或KAc）？ 为什么用70%乙醇清洗DNA沉淀而不是无水乙醇？
1. 2% CTAB抽提缓冲液
CTAB 2g， NaCl 8.18g ， EDTA-Na2-2H2O 0.74g， 10ml 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 先用 70ml ddH2O溶解, 再定容至100ml，灭菌, 冷却后 加入0.2% β-巯基乙醇0.2ml。
终浓度： CTAB 2%, NaCl 1.4mol/L（生理平衡 作用）, EDTA20mmol/L(螯合离子作用)，β-巯基 乙醇 100 mmol/L或PVP（聚乙烯吡咯烷酮 ）（降 低氧化酶类的活性，防止酚氧化成醌，有效去除 多酚。）
7.用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后，溶于适量的 灭菌ddH2O或TE缓冲液中。
注意事项
1）选取新鲜、幼嫩的பைடு நூலகம்料，避免研磨困难、材料含 有较多的多酚类物质、提取产物有颜色等；
2）研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液 充分混匀；
3）为获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过 程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地 搅拌，防止热变性，还要避免核酸降解酶的降解。
（二）获取程序及原理
1. 破壁破膜，释放染色体
利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；然后 加入CTAB缓冲液。
有效制备DNA时要考虑两个原则： 防止和抑制内源 DNase 对 DNA的降解； 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程 中DNase无法活动。
四、实验方法与步骤
1 .准备：2%CTAB 抽提缓冲液在65℃水浴中预热
2. 破碎细胞：取少量叶片（约1g）置于研钵中，倒 入液氮尽快研磨至粉状
3. 破膜、释放核蛋白：将3ml预热的CTAB缓冲液加 入10ml的离心管中，再将研磨的粉末用药匙转 移到离心管，充分混匀，65℃水浴中10 min ， 每隔几分钟 ，轻轻摇动（目的：65℃下染色体 充分释放）
2. 氯仿-异戊醇（24:1）：先加96ml氯仿，
再加4ml异戊醇，摇匀即可。
3. 1mol/LTris-HCl (pH8.0) 500ml：称取
60.57g Tris，用盐酸调至pH8.0，具有缓冲酸碱 度变化的作用。
4. TE 缓 冲 液 ： 10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)
+ 1mmol/L EDTA
高等植物总DNA提取
—— CTAB法AB法
实验类型：验证型
一、实验目的与要求
掌握CTAB法抽提植物DNA的基本原理。 学习并掌握CTAB法抽提植物DNA的技术和方法。
二、实验原理
（一）植物细胞中DNA在哪里？怎样获得？
➢ 植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为 核DNA、染色体DNA、核基因组DNA，细胞质中 也有少量DNA，主要分布在线粒体、叶绿体内，称 为核外DNA。 ➢ 细胞内的各种DNA称为总DNA。 ➢ 程序：破壁破膜→去蛋白质→沉淀DNA
复习题（判断）
将DNA提取液65度温育20分钟，可以灭活DNase。 （）
在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚， 说明其中蛋白质含量较高，可增加氯仿/异戊醇 抽提的次数或适当延长离心的时间。（ ）
DNA提取过程中避免剧烈震荡。（ ）
清洗DNA沉淀用的是无水乙醇。（ ）
复习题（简答）
复习题（填空）
TE的中文名是三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四 乙酸。
CTAB的作用主要是：溶解细胞膜，与核酸形成 复合物。
EDTA的作用主要是：螯合离子。 巯基乙醇 的作用主要是：降低氧化酶类的活性。
CTAB法提取DNA的一般程序是：破壁破膜、去 蛋白质、沉淀DNA。
Tris-HCl的作用：缓冲液，维持溶液pH值在8.0左 右，防止过酸、过碱破坏核酸。
3. 沉淀DNA
用异丙醇或乙醇沉淀DNA ，而 CTAB 因 溶于乙醇或异丙醇而被除去。
三、实验材料与器具
实验材料：大头菜的新鲜嫩叶 实验仪器：水浴锅、台式离心机、冰箱 实验器具：移液器、离心管、吸头、研钵和杵子、
液氮罐 实验药品：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、
Tris（三羟基甲基氨基甲烷）、EDTA(乙二胺四乙 酸)、氯仿、异戊醇、液氮、无水乙醇等
4.沉淀蛋白质及多糖杂质：8000r/m离心10min。
5.抽提除去蛋白质等杂质：将上清液转移到另一个 离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，混匀后， 12000r/m离心5 min。
6.沉淀DNA：用移液枪将上层水相吸入另一离心管 中，加2/3体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇， 轻轻混匀，于4℃下放置10 min或-20 ℃放置5min ， 使得核酸沉淀下来，用8000r/m离心5 min。此时 便可以观察到是否获得DNA沉淀。
五、作业
每两人提取一份DNA，请老师验收。 撰写实验报告。 在实验结果中说明每一操作步骤后DNA
在哪儿。
复习题（解释名词术语）
核DNA 核外DNA 基因组DNA 总DNA 离心 缓冲液 螯合剂
复习题（填空）
Tris的中文名是 三羟甲基氨基甲烷 。 CTAB的中文名是十六烷基三甲基溴化铵。 DNase的中文名是脱氧核糖核酸酶。 EDTA的中文名是乙二胺四乙酸。 PVP的中文名是 聚乙烯吡咯烷酮。 r/m （rpm）的中文意思是 转每分。 KAc的中文名是 乙酸钾（醋酸钾）。
加入CTAB，cetyltrimethylammonium bromide （十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂）
破坏细胞膜，使大分子DNA释放到提取缓冲液中； 保护DNA不受内源核酸酶的降解; 由于液氮研磨
对组织破碎程度很高且均匀，当加入螯合剂（如 EDTA、柠檬酸，通常 10 -100 mM）后，DNase 所需的辅助因子 Mg2+或Mn2+尚未开始作用已被 螯合剂掩盖；从而抑制DNA酶活性。
2.去蛋白质、多糖等杂质
CTAB 与核酸能形成复合物，在高盐溶液中可溶， 通过离心就可将 CTAB - 核酸的复合物与蛋白、多 糖类物质分开。 上清液中DNA再用氯仿-异戊醇混合液抽提，震 荡使核蛋白溶液乳化，然后离心，变性的蛋白质凝 胶便停留在水相和氯仿相中间，而 DNA 溶于上层 水相，吸出上层水相便可除去DNA中的蛋白质等。