贮存条件和灭菌次数对平板计数琼脂

分析检测贮存条件和灭菌次数对平板计数琼脂
培养基的影响
宋　洋
（宁德市食品药品检验检测中心，福建宁德 352100）
摘　要：本文探究不同贮存条件和灭菌次数对平板计数琼脂培养基的影响。

结果表明，平板计数琼脂培养基灭菌后在常温保存3 d、4 ℃保存3 d、灭菌3次的质量都符合GB 4789.28—2013要求。

将实验结果运用在实际工作中能提高培养基利用率和实验的便利性。

关键词：培养基；贮存条件；灭菌次数
Effect of Storage Conditions and Sterilization Times on Plate
Count Agar Medium
SONG Yang
(Ningde Centre for Food and Drug Control, Ningde 352100, China) Abstract: This paper explores the effects of different storage conditions and sterilization times on plate counting agar medium. The results showed that the quality of plate count agar medium after sterilization at room temperature for 3 days, 4 ℃ for 3 days and sterilization for 3 times met the requirements of GB 4789.28—2013. The application of the experimental results in practical work can improve the utilization rate of the culture medium and the convenience of the experiment.
Keywords: medium; storage condition; sterilization times
食品安全历来备受人们的重视，食品中微生物污染能够影响食品安全[1-2]。

人体摄入被微生物污染的食品后，容易引起食源性疾病，危害人们的身心健康。

食品微生物检验是运用微生物学的理论和实验方法，对食品中所含微生物的种类、数量、性质及其对人体的健康的影响进行判断，进而判别食品是否符合质量标准的检验方法。

开展食品微生物检验可以在一定程度上保障食品安全，食品中微生物菌落总数检验项目是食品微生物检验的常见项目，作为评价食品微生物污染状况的指标之一，可以直观反映食品中微生物数量[3-4]。

为了开展食品中微生物菌落总数检验项目，实验室经常会使用到平板计数琼脂培养基（Plate Count Agar，PCA），但在实际工作中，存在平板计数琼脂培养基配制过多，实验后剩余培养基保存后能否再次使用的问题[5]。

实验研究不同的贮存条件和灭菌次数对PCA培养基质量的影响，判断其是否符合《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）要求[6]。

1　材料与方法
1.1　菌株
大肠埃希氏菌 CMCC（B）44102（批号：220218；产品号：33053；规格：500～1 000 CFU/颗），来自北京三药科技开发公司；金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003，（批号：220216；产品号：33025；规格：500～1 000 CFU/颗），来自北京三药科技开发公司；枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501（批号：220812；产品号：33031；规格：500～1 000CFU/颗），来自北京三药科技开发公司。

1.2　培养基
平板计数琼脂培养基（PCA）（批号：1100441），
作者简介：宋洋（1990—），男，福建政和人，硕士，工程师。

研究方向：微生物检测、检测机构管理。

分析检测
广东环凯微生物有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）（批号：1103601），广东环凯微生物有限公司。

1.3　仪器设备
MLS-3751L-PC高压蒸汽灭菌器，日本三洋电子科技有限公司；GNP-9270型隔水氏恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；HFsafe-1200生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；HYC-940医用冷藏箱青岛海尔股份有限公司；YP3002电子天平，余姚金诺天平仪器有限公司；PHS-3C型pH计（E-201-P 平面pH复合电极），上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.4　实验方法
1.4.1　培养基的处理方法
（1）培养基配制及灭菌方法。

准确称取平板计数琼脂培养基（PCA）、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），加入对应量的超纯水，煮沸至溶解，121 ℃高压灭菌15 min。

（2）培养基灭菌方法。

第1 d配制两份PCA培养基并分别编1号和2号，灭菌后，取出自然冷却，将1号放入常温洁净环境存放3 d，将2号放入洁净冰箱4 ℃存放3 d，第4 d配制3号PCA培养基并灭菌，待3号自然冷却后，与新配制的4号PCA培养基一起放入灭菌，灭菌后自然冷却3号和4号，再将3号、4号与新配制的5号PCA培养基和TSA培养基一起灭菌，随后将1号和2号沸水浴加热融化。

上述培养基每份大约配制150 mL。

1.4.2　培养基性能测定
（1）理化特性。

①外观性状。

平板计数琼脂培养基的色泽、均匀度等变化。

②pH值。

培养基灭菌或融化后倒入无菌平皿制成平板，冷却至25 ℃时，测定平板上3个不同位置的pH值，取其平均值。

③培养基质量。

准确称取空瓶质量、灭菌前加入培养基后质量、灭菌后培养基的质量、贮存后培养基的质量。

④质量减少率。

培养基质量减少率=培养基减少的质量/培养基灭菌前质量，培养基减少质量=灭菌后减少质量+贮存过程减少质量。

（2）生长特性。

①菌落总数。

用无菌生理盐水溶解稀释菌株至每0.1 mL含菌数为100～150 CFU，分别吸取菌悬液0.1 mL，均匀涂布接种于待测平板和参比平板。

每一稀释度接种两个平板，置于（36±1）℃培养48 h，对菌落总数进行计数。

②生长率。

生长率测试是GB 4789.28—2013中培养基和试剂的质量控制的测试方法。

按规定用适当方法将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达到GB 4789.28—2013所规定的最低限值，生长率数值越大说明培养基越适合该种菌株的生长。

PCA培养基作为非选择性分离和计数固体培养基，按GB 4789.28—2013中非选择性分离和计数固体培养基的目标菌（质控菌株）生长率定量测试方法，PCA培养基质控菌株生长率（P R）= Ns/No，且应不小于0.7。

其中，Ns为待测PCA培养基平板上质控菌株菌落总数，CFU；No为参比（TSA）培养基平板上质控菌株菌落总数，CFU，该菌落总数应≥100 CFU。

PCA培养基质控菌株生长率定量测试中所用的质控菌株分别为大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

2　结果与分析
2.1　培养基理化特性测定结果和分析
按照1.4.2（1）方法，每次灭菌后观察培养基外观变化，测定25 ℃时的pH值并称重，结果见表1。

由表1可知，1号、2号、5号PCA培养基灭菌1次后常温保存3 d、4 ℃保存3 d、灭菌后现用对培养基灭菌后的质量、pH、外观影响不大；由5号、4号、3号可知，PCA培养基随着灭菌次数变多，灭菌后培养基的质量变小，pH值下降，培养基颜色加深，但均一度不变，也未见浑浊。

这主要由于高温灭菌导致培养基水分蒸发，质量变少，同时培养基中少部分还原糖类与氨基酸化合物高温下发生美拉德反应[7-8]，生成有色物质，影响培养基颜色，水分减少。

此外，高温可让部分培养基成分发生变化，导致pH下降但变化不大。

2.2　培养基生长特性测定结果与分析
2.2.1　菌落总数
按照1.4.2（2）方法，用不同质控菌株分别进行菌落总数的测定，结果见图1。

图1　不同处理条件下PCA培养基质控菌株的菌落总数
由图1可知，3株质控菌株在5种处理条件下的PCA培养基平板上的菌落总数存在差异，灭菌1次后现用且未经过保存3 d处理条件下的PCA 培养基上3种质控菌株的菌落总数均为最高。

由5号、4号、3号可知，随着PCA培养基灭菌次数增加3种质控菌株的菌落总逐渐减少，灭菌3次的PCA培养基上质控菌株的菌落总数最低；由1号、2号、5号可知，相比灭菌1次现用处理条件下的培养基，PCA培养基灭菌1次后常温保存3 d和4 ℃保存3 d处理条件下的3种质控菌株的菌落总数减少。

2.2.2　生长率测定结果与分析
按GB 4789.28—2013要求，PCA培养基质控菌株的生长率P R≥0.7。

由表2可知，3种质控菌株分别在经5种不同处理条件后的PCA培养基上的生长率都能达到P R≥0.7的要求。

说明这些处理对PCA培养基质量影响较小，仍满足培养基的质量标准要求。

表2　不同处理条件下PCA培养基的生长率结果
处理条件
P R
大肠埃希氏菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌
10.970.860.91
20.910.910.90
30.850.840.86
40.940.900.91
5 1.150.980.97
3　结论
《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）是关于培养基质量要求方面现行有效的国家标准。

此标准规定了培养基的质量应符合的基本要求和微生物学要求。

其中基本要求包括培养基外观、色泽、均一性和pH等方面；微生物要求指生长特性，包括生长率、选择性两方面。

若培养基的基本要求和微生物学要求均符合规定，则该批培养基可被接受，能够满足实验需要。

实验把食品微生物检验中经常使用的非选择性培养基中的PCA培养基当作研究对象，改变灭菌后PCA培养基的贮存条件或灭菌次数，按GB 4789.28—2013对培养基质量的要求，进行了pH值、色泽、均一度和质量等理化性质以及质控菌株生长情况和生长率的测定。

结果表明，PCA培养基灭菌后在常温保存3 d、4 ℃保存3 d、灭菌3次的质量都能符合GB 4789.28—2013要求，满足实验需求，不会影响培养基的性能，可能是由于PCA培养基组成成分简单、稳定，灭菌后放置贮存再融化和重复灭菌不易破坏有效成分，且PCA培养基为非选择性分离和计数固体培养基，极其适合微生物生长，所以微生物对PCA 培养基质量要求降低。

上述实验结果应用在实际工作中，可将实验剩余PCA培养基放置于洁净或无菌环境保存，短期内可灭菌或直接融化后再次使用，便于节省PCA培养基。

同时，若实验室预先配制并贮存PCA培养基也能够帮助解决因灭菌设备不足无法短期内完成大批量检验任务的问题，进一步提高实验便利性。

但从实验结果也可以看出，灭菌1次现用的PCA培养基最适合微生物生长，所以日常开展实验中仍尽可能采用这种方式处理培养基。

但是，不是所有培养基经过上述条件处理后都仍能满足实验需要。

不同培养基的组成成分不同，有些培养基组成成分复杂、不稳定，不能重复灭菌，或者有些培养基的组成成分在贮存过程中容易自行降解，甚至不同厂家不同批次的同一培养基也存在成分或质量差异，所以需要根据具体培养基的类别和性质开展实验验证后，才能确定贮存条件或灭菌次数对该培养基质量的影响。

此外，贮存培养基的环境应尽量保持洁净或无菌，贮存过程也应进行信息登记，才能保证培养基的质量。

表1　PCA培养基经不同处理后的理化特性结果
编号
空瓶
质量/g
灭菌前
质量/g
培养基
质量/g
灭菌
次数/次
贮存条件
灭菌后
质量/g
贮存后
质量/g
培养基质量
减少率/%
pH值外观
1147.8291.1143.31常温保存3 d286.7286.1 3.5 6.26黄色、均一度好、未见浑浊2147.6288.6141.01 4 ℃保存3 d285.1285.0 2.6 6.34黄色、均一度好、未见浑浊3145.8289.8144.03灭菌后现用277.1—8.8 6.04黄色加深、均一度好、
未见浑浊
4145.5290.6145.12灭菌后现用282.6— 5.5 6.16黄色较深、均一度好、
未见浑浊5147.9291.8143.91灭菌后现用287.7— 2.8 6.29黄色、均一度好、未见浑浊
（下转第109页）
MS -222在石斑鱼不同部位残留量见图2。

图2 石斑鱼肌肉和肝脏中MS-222的消除情况图
随着消除时间的延长，MS -222在石斑鱼肌肉和肝脏中的浓度在10 h 内呈先升高后逐渐降低的趋势。

在前2 h 内，肌肉残留量出现小幅度升高，最高残留浓度为20.56 mg·kg -1。

而肝脏在前5 h 内，出现大幅度的重吸收现象，最高残留浓度达到66.40 mg·kg -1。

在石斑鱼肌肉MS -222消除试验中，消除时间为24 h 时的MS -222残留浓度为2.08 mg·kg -1
，而消除时间为48 h 时MS -222残留量低于检测限；在肝脏中，5～10 h 内MS -222的消除速度极快，消除时间为48 h 时MS -222残留浓度为0.05 mg·kg -1，而消除时
间为72 h 时MS -222残留量低于检测限。

石斑鱼肝脏与肌肉的MS -222消除曲线相似，其中肌肉在48 h 时MS -222残留量降低到检测限以下，即完全消除，而肝脏在48 h 时MS -222残留量极小，在72 h 时
MS -222残留量降低到检测限以下，即完全消除。

3 结论
通过MS -222有效麻醉浓度选择试验和分析石斑鱼麻醉后样品中MS -222残留量，得出以下结论。

（1）通过24 h 麻醉及复苏试验，对比4个浓度MS -222麻醉药液浸泡石斑鱼的成活率和瘫痪率，得出MS -222有效麻醉浓度为120 mg·L -1。

（2）将石斑鱼在浓度为120 mg·L -1的MS -222麻醉药液中进行24 h 的药浴处理，MS -222在石斑鱼不同组织中残留有差异，肌肉中的最高残留浓度可达
到55.68 mg·kg -1，而在肝脏中的残留量比肌肉高，最高残留浓度可达到93.39 mg·kg -1。

在MS -222浓度为120 mg·L -1的消除试验中，MS -222在石斑鱼肝脏中完全消除时间比肌肉长，肌肉需要48 h ，肝脏为72 h 。

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（上接第101页）。