荧光探针的合成及自由基检测研究.

荧光探针的合成及自由基检测研究
摘要
荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增，其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点，且荧光现象具有有利的时间表度。

由于物质分子结构不同，其所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同，利用这一特性可以定性鉴别物质。

荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。

该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。

这种技术具备极高的灵敏性和极宽的动态时间响应范围的基本特点。

羟基自由基(HO·)和超氧阴离子自由基(O2-·)是生物体内活性氧代谢产生的物质，当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。

因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。

而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。

荧光探针检测自由基具有操作简便、响应迅速、选择性高等多种优点，我们将着重研究一类苯并噻唑结构荧光探针的合成及其对超氧阴离子自由基(O2-·)的检测。

关键词：荧光探针，苯并噻唑，超氧阴离子自由基，自由基检测
SYNTHESIS OF FLUORESCENT PROBES AND DETECTION OF FREE RADICALS
ABSTRACT
Applications of fluorescence analysis method in biochemistry, medicine, industry and chemical research grow with each passing day, the reason is that fluorescence analysis method has the advantages of high sensitivity, and the flurescence phenomenon has a favorable time characterization. Since the molecular structure of different materials, the absorption wavelength and fluorescence wavelength of the emitted light is different, this feature can be characterized using differential substances. Fluorescent probe technology is a method using photophysical and photochemical properties for researching some systems’physical and chemical process at the molecular level and detecting a particular structure and physical property of the special environment material. This technology not only can be used for steady-state nature of certain system, but also can monitore fast dynamic processes of a certain system such as the production and decay of a new species. This technology has the basic characteristics of a high degree of sensitivity and very wide dynamic range response time. Hydroxyl radical(HO-·)and superoxide anion radical(O2-·) is a substance produced in vivo metabolism of reactive oxygen species. When the body accumulates excess free radicals that will damage cells thereby causing chronic diseases and aging effects. Thus, in recent years people in order to prevent the occurrence of such diseases, the study of free radicals has become a hot spot. And fast, sensitive and practical method for the detection is very important. Using the fluorescent probes for the detection of free radicals is a simple, quick response, high selectivity variety of advantages. We will focus on the study of a class
of synthetic fluorescent probes of benzothiazole structure and detection of superoxide anion radical.
Key words：Fluorescent probes, Benzothiazole, Superoxide anion radical, Detection of free radicals
目录
1 绪论 (1)
1.1 引言 (1)
1.2 荧光 (1)
1.2.1 荧光的产生 (1)
1.2.2 荧光探针结构特点 (2)
1.2.3 荧光探针传感机理 (3)
1.2.4 常见荧光团 (3)
1.2.5 荧光探针的性能 (5)
1.2.6 影响荧光探针性能的因素 (5)
1.2.7 荧光淬灭 (5)
1.3 自由基 (6)
1.3.1 自由基的间接检测技术 (6)
1.3.2 自由基的直接检测技术 (7)
1.4 研究现状 (8)
1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测 (8)
1.4.2 2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉荧光探针 (8)
1.4.3 PF-1和PNF-1 (8)
1.4.4 香草醛缩苯胺 (8)
1.4.5 Hydroethidine类荧光探针 (9)
1.4.6 二(2,4-二硝基苯磺酰基)二氟荧光素 (9)
1.5 选题背景和意义 (10)
1.6 课题研究内容 (10)
2 荧光探针的合成 (11)
2.1 引言 (11)
2.2 还原文献 (11)
2.3 新探针合成 (11)
2.3.1 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (11)
2.3.2 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (12)
2.3.3 2-(苯)-苯并噻唑 (12)
2.3.4 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (12)
2.3.5 2-(4-硝基苯)-苯并噻唑 (13)
2.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (13)
2.4 合成小结 (14)
2.5 实验药品及规格 (14)
2.6 实验仪器及型号 (15)
3 实验结果与讨论 (16)
3.1 引言 (16)
3.2 荧光性能测试 (16)
3.2.1 荧光性能待测溶液配制 (16)
3.2.2 荧光性能测试结果 (16)
3.2.3 测试谱图 (17)
3.3 1H NMR数据 (21)
3.3.1 2-(2-吡啶)-苯并噻唑 (21)
3.3.2 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (22)
3.3.3 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (23)
3.3.4 2-(苯)-苯并噻唑 (24)
3.3.5 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (25)
3.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (25)
3.3.7 2-(2-噻吩)-苯并噻唑 (26)
3.4 反应条件控制及处理 (27)
3.5 结论与展望 (27)
参考文献 (28)
致谢 (30)
译文及原文 (31)
1 绪论
1.1 引言
荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增, 其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点, 且荧光现象具有有利的时间表度。

当物质吸收紫外光和可见光后, 它的电子能级跃迁至激发态, 然后将这一部分能量释放出来, 接着返回基态。

由于物质分子结构不同, 所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同。

利用这一特性, 可以定性鉴别物质。

研究分子的荧光光谱可为研究分子微观结构、分子的构象特点及变化情况提供帮助。

1.2 荧光
1.2.1 荧光的产生
图1-1 荧光的产生
如图1-1所示：当高能量光线照射荧光物质时，其分子或原子中的电子将吸收能量，由基态被激发到激发态。

激发态有两种电子态：一种为激发单线态(S)，另一种为激发三线态(T)。

电子处于高能级时不稳定，又会放出能量，从高能级跃迁回到低能级。

当电子从最低激发单线态S 1回到单线基态S 0时会发射出光子，
S 0S 22
我们称之为荧光；当电子从最低激发单线态S1系间窜越到最低激发三线态T1，再从T1回到单线基态S0时发射出光子，我们称之为磷光[1]。

电子从基态跃迁到激发态吸收的能量要高于荧光发射的能量，则荧光探针的发射波长总是大于其激发波长,两者之差值称为斯托克斯(Stokes)位移。

荧光分析就是利用Stokes位移将荧光染料的激发光与发射光分离开来,只检测发射光,从而提高检测的分辨率和灵敏度。

荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。

这种技术的基本特点是具备高度灵敏性和极宽的动态时间响应范围，正是基于这种特点，该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。

1.2.2 荧光探针结构特点
只有含荧光基团的物质才有可能发射荧光。

入射光照射时会产生荧光，而入射光一旦停止照射，荧光也几乎同时消失。

荧光探针的激发光谱、发射光谱和荧光强度都与荧光基团的结构有密切的关系。

其结构有以下特点：(1)含有共轭双键体系, 通常增加分子内π电子共轭体系的长度可提高荧光效率并使荧光红移; (2)具有芳环或杂环。

芳环越大, 其荧光峰越向长波长方向移动, 荧光强度往往也越强。

苯、萘仅在紫外区有荧光, 随着芳环的增加, 它们的荧光光谱可以进入可见光区; (3)具有刚性结构和平面结构的π电子共轭体系。

闭环可以增加分子共平面性和刚性，从而使荧光增强。

许多本身无荧光或者荧光很弱的化合物与金属鳌合产生具有环状结构的鳌合物时，会显示较强荧光。

如图1-2所示，汞离子络合导致硫代罗丹明B酰肼开环荧光增强[2]。

图1-2 硫代罗丹明B与汞离子络合
1.2.3 荧光探针传感机理
荧光分子探针是将至少两部分构件即受体结合部位和信号响应亚单位结合在一起的分子染料。

化学传感器的一个重要特征就是能够将受体对被分析物的结合作出信号响应。

大多数的被分析物自身并不具备信号发射团，因此设计一个荧光探针，就必须向体系中引入荧光团。

最普遍也是最早使用的方法是将荧光团与受体共价连结在一起。

除了上述共价结合发色团的方式以外，另一种方法是基于指示剂和被分析物对受体结合能力的不同。

这种方法荧光团和受体并非共价结合，而是形成了分子自组装体。

信号单元识别单元被检物质
+
无荧光荧光光照光照
图1-3 荧光探针和荧光传感
1.2.4 常见荧光团
荧光团是荧光分子探针的最基本组成部分, 作用是将分子识别信息表达为荧光信号。

荧光分子探针中的荧光团通过给出荧光强度的增强和减弱, 以及荧光峰值波长的位移等信息来反映微观世界的分子识别作用[3]。

以蒽、芘为主要代表的稠环芳烃类荧光团一般都是具有强而稳定的荧光，在荧光分子探针研究领域里, 它们作为结构最简单的荧光团经常用于基础理论的研究。

萘酰亚胺类化合物作为一种荧光团母核, 是很重要的有机功能染料中间体。

此外，以吲哚环和苯并噻唑、苯并噁唑或苯并吲哚等含氮杂环为骨架的碳菁类荧光团近年来研究比较活跃。

S
H
N
N O
O
NH HN
N N
N
S
N 图1-4 蒽的衍生物，萘酰亚胺衍生物，苯并噻唑衍生物
香豆素、荧光素、罗丹明类分子等因具有较高的量子产率也常被用于制备荧光底物[4]。

香豆素母体结构无色且无荧光，取代后的香豆素衍生物可以产生绿色荧光。

荧光素的量子产率高, 最大吸收/发射在492 /525 nm,大量的荧光素衍生物被合成并用作荧光检测试剂。

但荧光素衍生物也有如敏感性偏低、共轭体系不稳定、受环境因素影响较大等缺点。

罗丹明类最大吸收/发射在496 /520 nm, 与荧光素类衍生物相比具有更强的光稳定性, 更高的荧光量子产率以及更低的pH 敏感性。

由于目前没有合适的替代品，荧光素和罗丹明在生物医学领域内仍然是应用最为广泛的荧光团。

O O O COOH
HO O
O
N N+
COOH
图1-5 香豆素，荧光素，罗丹明B
卟啉和酞菁容易和不同金属离子反应形成多种配合物，具有较高的荧光量子
产率和较大的Stokes位移。

氟硼类荧光染料(BODIPY)类也具有结构稳定及量子产率高的特点。

1.2.5 荧光探针的性能
(1)Stokes位移
Stokes位移越大荧光探针检测越灵敏。

(2)荧光强度
荧光探针发射荧光的光量子数目为荧光强度，决定了荧光探针检测的灵敏度。

(3)荧光寿命
荧光寿命指分子在激发态的平均时间，即激发态寿命。

不同性质的被测物可应用荧光寿命不同的荧光探针采取不同方法检测。

1.2.6 影响荧光探针性能的因素
合理的分子结构是影响荧光探针性能的首要因素。

选择结构恰当的荧光探针检测不同结构的被测物，才能发挥荧光探针检测简便而迅速的优点。

刚性结构可增加荧光强度,若π电子共轭体系分子是刚性平面结构,分子则不易发生变形,而保持大的平面结构也就保持了大的π电子共轭度。

同时荧光效率随着π电子共轭程度和分子平面度的增加而增大,其所发生的荧光光谱将向长波方向移动[5]。

荧光探针的取代基对其性能的影响非常大。

推电子基团可以使荧光分子共轭体系增大，其荧光一般都会增强，如-OH、-OR、-NHR、-NR等。

而吸电子基团的一般会使荧光减弱，如-C=O、-CHO、-COR、-COOH、-NO2、-N=N-等。

卤素的取代称为重原子的取代，可以使荧光减弱而磷光增强。

此外还有一些环境因素也会对检测产生影响，如探针浓度、溶剂性质、pH 值、温度等。

1.2.7 荧光淬灭
通过各种原因使荧光探针的荧光强度降低，导致荧光探针的浓度与荧光强度不呈线性关系的现象称为荧光淬灭。

引起荧光淬灭的物质称为淬灭剂。

在使用荧光探针进行检测时，也应密切关注是否有淬灭剂存在及其对检测的影响。

1.3 自由基
自由基(free radical)，又称游离基，是指化合物的分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。

自由基极易发生反应，具有强氧化性。

有机化合物发生化学反应时，总是伴随一部分共价键的断裂和新的共价键的生成，必不可少会生成自由基。

常见的自由基包括超氧阴离子自由基(O2-·)，羟基自由基(HO·)，过氧羟自由基(HO2·)，过氧自由基(ROO·）和烷氧基（RO·）。

羟基自由基(HO·)和超氧阴离子自由基(O2-·)是生物体内活性氧代谢产生的物质，O2-·是形成不同活性氧自由基链中的第一个自由基，是生物体内一种极其重要的氧化型自由基，是化学反应和生命过程中的电子受体。

正常情况下，机体的自由基清除系统可使自由基的产生与消除保持在极低的动态平衡水平上，对机体是有利的，但当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。

因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。

而快速、灵敏和使用的自由基检测方法就显得十分重要。

随着各种仪器分析技术的发展以及新试剂的开发利用，自由基的检测技术也出现了新的进展。

目前，可以将检测自由基的方法与技术分为间接检测法和直接检测法[6]。

1.3.1 自由基的间接检测技术
(1) 光度法
用捕获剂来捕获自由基，利用捕获剂的颜色发生变化，是光度法的基本原理。

对于羟基自由基，常用的检测方法有水杨酸法，铁氧化邻二氮菲法，细胞色素C 氧化法，脱氧核糖法，萃取-催化氧化光度法等。

而超氧自由基的分光光度法测定，最常用的方法有细胞色素C的超氧自由基还原法和硝基四氮唑篮(nitro blue tetrazolium,NBT)还原法。

国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法。

光度法操作简单，费用少，仪器设备价格低廉，但常规光度法检测的灵敏度较低检测限较高，专一性不强。

而使用荧光探针进行检测可以避免这些缺点。

用荧光探针来检测自由基的含量时，使用的捕获剂在捕获自由基后会发生荧光强度的变化。

在常见的捕获剂中，荧光强度减弱的捕获剂有Ce3+、罗丹明6G、水杨基荧光酮，而荧光增强的有苯甲酸、Hantzsch反应等[7]。

通过测定荧光强度
的变化可以间接定量测定羟基自由基的产生量。

(2) 高效液相色谱法
高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）作为一种间接检测自由基的技术已经得到广泛的应用。

由于HPLC的高分离效率，加之与各种检测手段如紫外检测（UV）、电化学检测（ED）、质谱检测（MD）等联用，可实现各种复杂体系中的痕量自由基检测。

(3) 化学发光技术
化学发光技术（chemiluminescence，CL）可以作为一种非常灵敏的生物体代谢物、自由基以及抗氧化剂检测技术。

其优势是利用了发光试剂与自由基反应后能直接发光的原理，根据光强度，确定自由基的量。

通过测定荧光强度的变化可以间接定量测定羟基自由基的产生量。

(4) 自旋捕集技术
20 世纪60 年代发展的电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）（也称电子自旋共振(electron spin resonance，ESR)）技术在光化学、电化学、高聚物、核辐射以及生物学领域中已得到广泛的应用。

1.3.2 自由基的直接检测技术
(1) 电化学法
电化学法既是一种产生自由基的重要方法，同时也是用于自由基检测的一种方法，所以该方法可实现自由基的原位产生及检测。

电化学检测方法所用仪器简单、实用，但是由于电化学检测抗干扰能力不强，不适用复杂体系中的自由基的检测，应用范围有限。

(2) 毛细管电泳技术
相对于HPLC，毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）检测自由基具有仪器较简单，分析费用更低的特点。

将CE与电化学检测结合后，灵敏度可以很高。

荧光探针检测自由基具有操作简便，响应迅速，选择性高等多种优点，我们将着重研究荧光探针的合成及其对超氧阴离子自由基(O2-·)的检测。

1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测
SOD 的生理作用是清除体内的超氧阴离子，从而起着保护细胞的作用[8]。

通过检测SOD 的活性可以间接检测O 2-·的含量。

国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法(简称Marklund 法)，该方法定义一定条件下1mL 的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在420nm 波长的自氧化速率达50%的酶量定为1个活力单位。

这种方法易受到容易的酸碱度、温度等多种环境因素影响[9]。

1.4.2 2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉荧光探针
2004年唐波等合成了2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉作为新型的检测超氧阴离子自由基(O 2-·)的荧光探针，由于探针只能被O 2-·氧化，而共存的过氧化氢和羟基自由基(HO ·)都不会对其有影响，因而该探针具有良好的专一性，并建立了流动注射荧光法测定O 2-·的方法[10]。

N S
N
图1-6 2-(2-吡啶)-苯并噻唑
1.4.3 PF-1和PNF-1
2006 年唐波等设计合成了两种新型的荧光探针：PF-1 和 PNF-1。

这两个探针分别以荧光素和萘荧光素为荧光母体，连接了对O 2-·响应的二苯基次膦酰基，当遇到O 2-·时，酯键断裂，母体的荧光恢复。

该探针成功的检测了巨噬细胞中O 2-·。

两种新型荧光探针都有高选择性、高灵敏度、水溶性好及良好的生物相容性等优点[11]。

O O O P Ph 2P Ph 2O
O O O
O P Ph 2
P Ph 2O
图1-7 PF-1和PNF-1
1.4.4 香草醛缩苯胺
2009年蒲法章等设计合成了一种新的荧光探针试剂香草醛缩苯胺。

香草醛缩苯胺有荧光，当遇到时O 2-·时被氧化成醌式结构导致其荧光猝灭。

其不足之
处在于其激发波长处于紫外可见区，进行细胞成像时，生物组织会有背景荧光的干扰，而且激发光能量高，对生物体造成一定损伤[12]。

N
OCH3
HO
图1-8 香草醛缩苯胺
1.4.5 Hydroethidine类荧光探针
Hydroethidine ( HE)被认为是一种选择性和灵敏性都很好的超氧阴离子的荧光探针。

与其结构相似的PE、Mito-HE及二氢乙锭( DHE)均可以用作超氧阴离子的荧光探针[13]。

NH2
N
H2N
Et
NH2
N
H2
Et
O
NH2
N
H2
Et
图1-9 HE，Mito-HE和DHE
1.4.6 二(2,4-二硝基苯磺酰基)二氟荧光素
2005年Meada等报道了一种能够检测O2-·的荧光探针二(2,4-二硝基苯磺酰基)
二氟荧光素类化合物，探针的设计是基于非氧化还原机理，在模拟生理条件下，可以实现对O2-·的高选择性识别，且成功实现了对人类嗜中性粒细胞中O2-·的检测。

但由于该探针是一种二氟荧光素类化合物，它的水溶性比较差，并且与O2-·反应时间较长，此外在实际生物样品检测时浓度较高的谷胱甘肽(GSH) 可能产生干扰，所以该探针的性能有待进一步改进[14]。

O
O
Y Y O X
O
O
X
DNS DNS
图1-10 二(2,4-二硝基苯磺酰基)二氟荧光素
-·)在生物体内起到重要作用，实现对超氧阴离子自超氧阴离子自由基(O
2
由基的定量检测非常重要。

不仅可以指导我们设计更科学合理的荧光探针，而且对新型药物的开发、实验某些重大疾病的早期诊断和预防油脂重要的科学意义[15]。

杂环化合物具有广泛的生物活性，在医药、农药和生命科学等各个领域都占有极其重要的地位，这类化合物的合成一直是有机合成领域的研究热点。

现代有机合成技术的发展为杂原子及杂环化合物的合成提供了新的方法。

苯并噻唑类化合物作为一类荧光材料具有独特的优势，如强蓝绿色荧光发射、易纯化等。

作为有机小分子化合物，苯并噻唑分子化学结构易于调整，可以通过引入双键、苯环等不饱和基团以及各种生色团来改变共轭程度进而改变发光波长，从而设计出更多的荧光分子探针结构。

期望合成的荧光分子探针在进一步研究的基础上，能够在环境科学和生命科学的研究领域得到应用。

而用2-氨基苯硫酚来合成2-芳基苯并噻唑所用的原料都是常见易得的，其中2-氨基苯硫酚与醛反应合成2-芳基苯并噻唑较为常见。

因为该反应在多种不同的介质中或无溶剂条件下均可顺利进行，而且反应时间相对不是很长，条件比较温和。

1.6 课题研究内容
我们采用不同取代基的苯甲醛如4-二甲胺基苯甲醛，4-氰基苯甲醛，4-甲基苯甲醛等化合物，与2-氨基苯硫酚反应合成一系列苯并噻唑类荧光探针，经1H NMR，紫外可见光分光光度计等分析方法鉴定，探究不同取代基对荧光传感性能的影响，筛选荧光探针定量检测生物体系中的超氧阴离子自由基（O2-·）。

2 荧光探针的合成
2.1 引言
如图2-1所示，我们将使用2-氨基苯硫酚与不同取代基的4取代苯甲醛反应生成得到未被氧化的2取代苯并噻唑啉作为荧光探针，-X代表如氰基，二甲氨基，硝基等不同的取代基团。

该探针经超氧阴离子自由基（O2-·）氧化后形成的2取代苯并噻唑具有荧光，因而可以用来进行超氧阴离子自由基检测。

通过改变反应溶剂、控制反应温度等不同因素改善合成方法以求得到更快的反应速率及更高的产率。

SH
NH2
OHC X
N
H
S
X
N
H
S
X
N
S
X
O
2
-·
+
图2-1 合成路线
2.2 还原文献
我们首先对2004年唐波等合成的2-(2-吡啶)-苯并噻唑[10]进行了还原实验。

将0.4280g 2-(2-吡啶)-苯甲醛和0.5002g邻氨基苯硫酚溶于20ml乙醇中加热回流2h，抽干溶剂得到黄色油状液体，使用乙醚微热溶解重结晶。

产品与文献[10]中结果相吻合，性能良好。

2.3 新探针合成
2.3.1 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑
(1) 初次合成
首先使用与文献[10]相同的反应方法进行合成。

将1.4410g 2-氨基苯硫酚溶于
20ml乙醇中，加入1.3601g 4-二甲氨基苯甲醛，加热回流1.5h后待其自然冷却后放入冰箱过夜得到淡黄色结晶，过滤后真空烘干。

1H NMR检测为氧化产物，无法进行自由基检测。

(2) 改进方法
考虑到该探针易被空气氧化，先将1.5026g 4-二甲氨基苯甲醛溶于20ml甲醇中，抽真空后通入N2保护，使用注射器注入1.4988g 2-氨基苯硫酚，加热回流1.5h，冷却得到淡黄色沉淀，抽滤后产物用甲醇洗，得到白色固体，真空烘干。

1H NMR检测为少量氧化产物及未氧化产物混合物。

但该探针荧光强度较高，由于有氧化产物干扰所以无法进行检测。

2.3.2 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑
(1)初次合成[16]
称取0.5240g 4-氰基苯甲醛和0.5001g 2-氨基苯硫酚分别溶于总计30ml乙醇中后混合加热回流1.5h，冷却后出现白色沉淀，使用乙醇加热溶解，冷却后得到晶体，过滤后真空烘干。

1H NMR检测为氧化产物，无法进行自由基检测。

(2)改进方法
称取1.3512g 4-氰基苯甲醛溶于20ml甲醇中，抽真空N2保护下注射器注入1.5002g 2-氨基苯硫酚，加热回流1.5h，停止反应后放入冰箱冷却结晶，使用甲醇洗，1H NMR检测发现难以分离原料，并且有部分氧化产物产生荧光干扰，无法进行自由基检测。

2.3.3 2-(苯)-苯并噻唑
(1)初次合成
将0.2504g 2-氨基苯硫酚溶于10ml乙醇中，抽真空后通入N2保护，使用注射器注入0.2122g苯甲醛，加热回流1.5h，冷却后得到白色针状晶体，用乙醇洗后真空烘干，1H NMR检测为氧化产物，无法进行自由基检测。

(2)改进方法
称取0.2504g 2-氨基苯硫酚和0.2122g苯甲醛置于两口烧瓶中，加入10ml 水，加热回流1.5h后蒸干溶剂，使用乙醇重结晶，得到淡黄色晶体，过滤后真空烘干，1H NMR检测为氧化产物，无法进行自由基检测。

2.3.4 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑
(1)初次合成
将1.2520g 2-氨基苯硫酚溶于20ml甲醇中，加入1.0150g 4-甲基苯甲醛片刻即出现黄色固体，加热回流1.5h，旋蒸出部分溶剂后静置过夜，出现大量黄色固体，过滤后真空烘干。

1H NMR检测为氧化产物，无法进行自由基检测。

(2)改进方法
将1.2519g 2-氨基苯硫酚至于两口烧瓶中，抽真空后通入N2保护，用注射器注入20ml乙醚及1.2015g 4-甲基苯甲醛，常温搅拌1.5h，旋蒸出溶剂后用乙醚洗得到白色粉末，真空烘干。

1H NMR检测有部分氧化产物，无法进行自由基检测。

2.3.5 2-(4-硝基苯)-苯并噻唑
将0.3022g 4-硝基苯甲醛及0.2504g 2-氨基苯硫酚置于两口烧瓶中，加入10ml 乙醇，加热回流3h后无明显现象发生，与原料点板对照只有极少量产物生成。

2.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑
(1)初次合成[17]
将1.2520g 2-氨基苯硫酚溶于20ml甲醇中，抽真空后通入N2保护，使用注射器注入1.2212g水杨醛，立刻开始有白色固体生成。

常温搅拌1.5h。

有大量固体，移走液体后用甲醇洗后过柱分离，真空烘干，1H NMR检测为氧化产物，无法进行自由基检测。

(2)改进方法
将1.0020g 2-氨基苯硫酚溶于15ml四氢呋喃中，抽真空后通入N2保护，使用注射器注入1.1501g水杨醛，搅拌5h后抽干溶剂，使用正己烷洗，产量较低且难以分离。

2.3.7 2-(2-噻吩)-苯并噻唑
(1)2-噻吩甲醛合成
将1.8273g N,N-二甲基酰胺及2.1035g噻吩至于两口烧瓶中，抽真空后通入N2保护，使用注射器注入3.8333g三氯氧磷，溶液变为红色，90℃回流6h，冷却后导入碎冰中，使用30%氢氧化钠溶液调至pH=6，静置后使用乙醚萃取，合并有机层，使用无水硫酸镁干燥过夜，旋蒸溶剂得到2-噻吩甲醛。

(2)探针合成[18]
称取1.2234g 2-氨基苯硫酚溶于20ml乙醇中，抽真空通入N2保护，使用注射器注入1.2150g 2-噻吩甲醛，加热回流2h，冷却后得到橙红色沉淀。

在1H NMR。