正交试验法优化白金胶囊中白芍的提取工艺

正交试验法优化白金胶囊中白芍的提取工艺
目的采用正交试验法优选白金胶囊中白芍的提取工艺。

方法采用正交设计,以白芍中芍药苷及白芍总苷的提取率作为评价指标,考察溶剂用量、提取时间和提取次数对提取结果的影响,确定最佳提取工艺。

结果白芍的最佳提取工艺为：14倍量70%乙醇,回流提取3次,每次1.5 h。

结论本试验方法简单稳定,对白金胶囊的生产工艺具有一定的指导和参考意义。

Abstract：Objective To optimize the extraction process of Radix Paeoniae Alba in Baijin Capsule by orthogonal experiment. Methods The study employed the extraction rate of paeoniflorin and total glucosides of paeony as evaluation indexes. The orthogonal design was used to investigate effects of solvent volume, extraction time and extraction frequency on extraction results. Results The optimal extracting condition was extracted 3 times, with 14 fold 70% alcohol, 1.5 h for each time. Conclusion The method is simple and steady, which will provide instruction and reference to the production of Baijin Capsule.
Key words：orthogonal experiment；Radix Paeoniae Alba；Baijin Capsule；extraction process
白金胶囊处方为中日友好医院临床经验方,由白芍、合欢花等组成,具有解郁安神功效,主要用于治疗心神不安、忧郁失眠及肝郁神怯所致的抑郁症等。

白芍为该处方臣药之一,具有养血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗功效[1]。

药理研究表明,白芍有明显的镇静作用[2],白芍总苷能促进正常大鼠的睡眠,并可改善睡眠障碍以及运动后失眠大鼠的睡眠状况[3]。

白芍中主要有效成分为芍药苷等单萜类化合物[4],即白芍总苷。

本试验采用L9(34)正交设计,以芍药苷及白芍总苷的提取率作为评价指标,考察溶剂用量、提取时间及提取次数对提取效果的影响,优化筛选白芍的最佳提取工艺,为白金胶囊的实际生产提供依据。

1仪器与试药
安捷伦1260高效液相色谱仪,KQ3200DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),BT125D型电
子天平(赛多利斯,0.01 mg),SHB-Ⅲ型循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),旋转蒸发器RE-52A(上海振捷实验设备有限公司),DZ-2BC型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

白芍药材(批号201002298),购自北京同仁堂饮片有限责任公司；芍药苷对照品(110736-201337)、苯甲酸对照品(100419-201302),购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯。

2方法与结果
2.1芍药苷含量测定
2.1.1色谱条件色谱柱：Agilent Extend-C18(5 μm, 250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230 nm[5]；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。

2.1.2对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥24 h的芍药苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含芍药苷0.06 mg的溶液,即得。

2.1.3供试品溶液的制备精密称取白芍干浸膏,用甲醇定容至50 mL容量瓶,摇匀,滤过,取续滤液,微孔滤膜(0.22 洀)滤过,即得。

2.1.4线性关系考察精密称取芍药苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.98 mg的芍药苷对照品溶液,依次用甲醇稀释至浓度为9.8、19.6、39.2、98、392、588、980 最/mL,得系列对照品溶液,依次吸取上述对照品溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪,以对照品的浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标进行线性回归,得回归方程Y＝14 814X－5.266 66,r＝0.999 9,芍药苷在0.098～9.8 最蔀线性关系良好。

2.1.5测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 L,注入高效液相色谱仪,按“2.1.1”项下色谱条件进样测定,即得。

色谱图见图1。

A
B
注：A.对照品；B.供试品
图1白金胶囊中芍药苷高效液相色谱图
2.2白芍总苷含量测定
2.2.1色谱条件色谱柱：Agilent Extend-C18(5 μm, 250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钾-异丙醇-冰乙酸(87∶173∶4∶4)[6]；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取苯甲酸对照品5.31 mg,置25 mL量瓶中,加
甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取1 mL置25 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

2.2.3供试品溶液的制备取白芍药材中粉约0.1 g,精密称定,置50 mL量瓶中,加稀乙醇35 mL,超声处理(功率240 W,频率45 kHz)30 min,放冷,加稀乙醇至刻度,摇匀,滤过,药渣用适量乙醇洗涤,并入滤液,水浴挥干,残渣用5%氢氧化钠溶液25 mL溶解,取该溶液1.0 mL置10 mL具塞试管中,沸水浴水解2 h,取出,冷却至室温,加流动相至10 mL,摇匀,取续滤液,0.22 洀微孔滤膜滤过,即得[7]。

2.2.4标准曲线的制备精密吸取对照品溶液1、2、4、5、6、8、10、15、20 μL 注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积积分值为纵坐标,进样量为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y＝6137.7X－8.650 1,苯甲酸在0.008 496～0.169 92 最范围内线性关系良好。

2.2.5精密度试验精密吸取苯甲酸对照品溶液各10 μL,重复进样6次,测定峰面积,计算RSD＝1.57%,结果表明仪器精密度良好。

2.2.6重复性试验精密称取同一批次白芍药材中粉6份,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,分别记录峰面积,计算苯甲酸含量RSD＝1.14%,表明方法重复性良好。

2.2.7稳定性试验精密吸取“2.2.3”项下供试品溶液,于制备后0、2、4、8、10、18、20、24 h进样测定,计算苯甲酸的含量,结果RSD＝0.85%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8加样回收率试验精密称取同一批号的白芍药材中粉6份,每份0.1 g,分别精密加入苯甲酸对照品0.72 mg,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液。

按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,计算回收率。

结果平均回收率为101.92%,RSD＝1.84%,表明本方法稳定可靠。

2.2.9样品的测定精密称取白芍浸膏粉0.03 g,按”2.2.3”项下方法,自“用5%氢氧化钠溶液25 mL溶解”起制备供试品溶液,精密吸取供试品溶液10 μL注入液相色谱仪,测定峰面积,所得结果按回归方程及公式[白芍总苷含量(%)＝苯甲酸含量(%)×480.27÷122.12][8]计算,即得白芍总苷含量。

色谱图见图2。

A
B
注：A.对照品；B.供试品
图2白金胶囊中苯甲酸高效液相色谱图
2.3正交试验
2.3.1正交设计选择溶剂用量、提取时间、提取次数为3个因素,每个因素分别设3个水平,因素水平见表1。

表1正交试验因素水平表
水平溶剂用量(倍) 提取时间(h) 提取次数(次)
A B C
1 10 1.0 2
2 12 1.5 3
3 1
4 2.0 4
2.3.2结果与分析称取20 g白芍药材9份,按L9(34)正交表安排试验,以芍药苷及白芍总苷的提取率作为考察指标,正交试验结果见表2,方差分析见表3、表4。

其中,提取率(%)＝芍药苷含量(白芍总苷含量)÷本批白芍药材中芍药苷含量(白芍总苷含量)×100%。

本批白芍药材中芍药苷含量为1.80%,白芍总苷含量为2.78%。

表2正交试验结果
试验号 A B C D 芍药苷(%) 白芍总苷(%)
1 1 1 1 1 70.57 71.09
2 1 2 2 2 89.10 85.39
3 1 3 3 3 70.28 81.25
4 2 1 2 3 88.23 80.54
5 2 2 3 1 96.72 92.43
6 2 3 1 2 78.01 82.04
7 3 1 3 2 80.90 84.91
8 3 2 1 3 88.28 85.48
9 3 3 2 1 98.15 95.74
芍
药
苷Ⅰj 76.651 79.896 78.950 88.478
Ⅱj 87.650 91.365 91.826 82.688
Ⅲj 89.108 82.146 82.632 82.262
Rj 12.457 11.469 12.876 6.216
白Ⅰj 79.241 78.845 79.532 86.419
芍Ⅱj 85.000 87.765 87.223 84.113
总Ⅲj 88.710 86.342 86.196 82.419
苷Rj 9.469 8.920 7.691 4.000
表3芍药苷提取率方差分析
方差来源离均差平方和自由度方差F值P值
A 278.266 2 139.133 3.834 0.207
B 221.598 2 110.799 3.053 0.247
C 263.902 2 131.951 3.636 0.216
误差72.574 2 36.287
表4白芍总苷提取率方差分析
方差来源离均差平方和自由度方差F值P值
A 136.585 2 68.292 5.647 0.150
B 137.815 2 58.908 5.698 0.149
C 104.612 2 52.306 4.325 0.188
误差24.188 2 12.094
方差分析结果表明,A(溶剂用量)、B(提取时间)、C(提取次数)三因素对芍药苷及白芍总苷的提取率均没有显著影响。

根据正交表直观分析,芍药苷及白芍总苷最佳提取工艺均为A3B2C2,即14倍量70%乙醇,提取3次,每次1.5 h。

2.4验证试验
称取白芍药材20 g,按优选工艺进行验证试验,结果见表5。

可见,验证试验中芍药苷及白芍总苷的提取率均＞95%,相对较高,说明优选工艺稳定可行。

表5验证试验结果(%)
试验号出膏率芍药苷提取率白芍总苷提取率
1 18.25 97.33 95.71
2 18.30 98.62 97.62
3 18.11 96.61 98.10
均值18.22 97.51 97.14
3讨论
根据相关文献[9]及预试验可知,白芍的醇提工艺优于水提工艺,同时70%乙醇[10-13]回流提取所得白芍的主要有效成分含量较高,因此,选用70%乙醇作为白芍的提取溶剂。

验证试验中,优选的提取工艺芍药苷的提取率未高于9号试验组,综合考虑成本及生产实际,为节省能耗,节约资源,选择最佳工艺为70%乙醇、14倍量、提取3次、每次1.5 h。

影响中药提取工艺过程的因素较多,本试验采用多指标结合正交试验法对白芍提取工艺进行了考察,以白芍中主要成分芍药苷及大类成分白芍总苷的提取率为控制指标优选提取工艺,确定最佳工艺。

该工艺稳定、可行,适用于白金胶囊的工业化生产。

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(收稿日期：2013-08-29；编辑：陈静)。