水体细菌微生物多波长散射光谱快速定量检测_王久悦

建立了隐 孢 子 虫 的 ＵＶ－Ｖ ａ ｍ ｌ ａ ｈ ａ ｎ ｉ ｓ透 射 光 谱 的 解 释 模 型 ， Ｃ 得到了 隐 孢 子 虫 的 很 多 定 量 信 息 ， 并 对 解 释 模 型 做 出 评
６］ 。 价［ ｅ ｒ ｅ ｂ ｒ ｅ ｎ ｎ ｉ ｋ ｏ ｖ ａ Ｙ Ｍ 等 利 用 ＵＶ－Ｖ ｉ ｓ透 射 光 谱 对 疟 原 Ｓ 虫的三个生长阶段加以研究 ，建立的模型 可 以 准 确 的 体 现 疟 ７］ 。这些研究以散 射 光 或 吸 收 光 谱 为 原虫各阶段的生长性质 ［
是近年来发展 的 细 菌 快 速 检 测 仪 器 ，其 原 理 是 根 据 瑞
主 ，快速解析得到微生物的各 项 特 征 参 数 ，光 谱 学 检 测 方 法 相对于生物学检测方法提升了细菌检测 的 速 度 ，但 是 光 谱 学 检测方法研究尚未成熟 ，还处在研发阶段有待进一步完善 。 分析了紫外可见透射光谱中的前向 散 射 光 谱 ，建 立 了 细 菌前向散射光谱的解释模 型 ，并 利 用 该 模 型 对 大 肠 杆 菌 ４ ０ ０ ０ ０ｎ ｍ 范围内 散 射 光 谱 进 行 了 快 速 解 析 ，得 到 了 细 菌 的 ～９ 、 大小 浓度等信息 ，并且分析了 不 同 生 长 时 期 大 肠 杆 菌 和 肺 炎克雷伯菌的光谱的变化特性 ，为进一步 的 水 体 细 菌 快 速 检
］ ［ ２ １ －
析研究 ：杨新慧等研究了红细 胞 前 向 散 射 光 ，得 到 平 均 红 细
３］ ；Ｇ 胞容量和血红蛋白量 等 值 ［ ａ ｒ ｃ ｉ ａ ｕ ｂ ｉ ｏ Ｌ Ｈ 等利用散射 －Ｒ ， 光理论分析了细菌的各项解析特征 进行 细 菌 分 类 鉴 别 的 研 ４］ ；Ａ 究［ ｌ ｕ ｏ ａ ｅ ｉ Ｃ Ｅ 等基于 Ｍ ｉ ｅ散 射 理 论 对 细 菌 和 孢 子 进 行 ｐ ５］ ； 散射 光 谱 解 析 ， 得 到 了 细 菌 不 同 的 生 长 特 征 等 参 数 ［
３ ３ ４ 测提供了方法 。
光谱学与光谱分析 第 ３ ７卷 对测量得到的细菌的前向散射光谱进行 解 析 ，得 到 相 应 的 外 部结构的大小 ，内部结构的大 小 ，结 构 比 例 以 及 细 菌 浓 度 等 相关定量信息 ，为进一步的细菌快速检测 提 供 理 论 依 据 和 实 验基础 。
第３ 第２期 光 谱 学 与 光 谱 分 析 ７卷 ， ｃ ｔ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ａ ｎ ｄ Ｓ ｅ ｃ ｔ ｒ ａ ｌ Ａ ｎ ａ ｌ ｓ ｉ ｓ ｅ ２ ０ １ ７ 年 ２ 月 Ｓ ｐ ２， ３ ３ ３ ３ ７ Ｖ ３ － ｐ ｐ ， Ｆ ｅ ｂ ｒ ｕ ａ ｒ ２ ０ １ ７ ｙ
摘 要 通过分析细菌细胞的结构特征 ，将细菌菌体的 多 波 长 散 射 分 为 外 部 结 构 散 射 和 内 部 结 构 散 射 两 个 部分 ，建立了细菌菌体前向散射光谱解释模型 。利 用 该 模 型 对 大 肠 杆 菌 ４ ０ ０～９ ０ ０ｎ ｍ 波段的前向散射光进 行了快速解析 ，得到了大肠杆菌外部结构 、内部结构的平均粒径大小及两结构占细菌体前向散射的比例 ；基 于单细胞的散射光密度与整体细菌悬浮液光密度之间 的 关 系 可 以 快 速 检 测 出 细 菌 的 浓 度 。多 次 细 菌 浓 度 测 量 结果之间的最大差异为 １ ． ８ ３％ ，且与平板法相比较 ，测量结果在同一量级 ，相对误差为 ３ ． ４ ４％ 。对不同生 长时期的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌 进 行 了 光 谱 解 析 ，得 到 了 两 种 细 菌 浓 度 及 菌 体 大 小 随 时 间 的 变 化 曲 线 。 研究结果不仅为细菌微生物生长过程的科学研究提供 了 一 种 快 捷 方 法 ，而 且 为 水 体 细 菌 微 生 物 的 快 速 检 测 与预警提供了技术手段 。 关键词 散射光谱 ；Ｍ ｉ ｅ散射 ；细菌结构 ；细菌浓度 ： ／ （ ） 中图分类号 ： ０ ０ ０ ０ ４ ３ ３ ． ４ 文献标识码 ：Ａ Ｄ Ｏ Ｉ １ ０ ． ３ ９ ６ ４ ５ ９ ３ ２ ０ １ ７ ２ ３ ３ ３ ５ Ｏ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ０ － － － ｊ 过程简便等优点 。已有一些学者对多波长 的 散 射 光 谱 进 行 分
为了提高检测细菌内部结构外部结构大小的准确性先消除浓度的影响对400900nm范围内测量得到的uvvis前向散射光谱进行总光密度强度归一化处理ii900i400i8433光谱学与光谱分析第37卷对于大肠杆菌的多波长散射光谱式6中的复折射率只有实部部分用cauchy公式近似大肠杆菌外部折射率为5n1377630349129内部结构比外部结构多了一些蛋白质和多糖等的组分平均内部折射率为5n1555900210代入式3归一化采用非线性模型中的阻尼lm最小二乘算法对400900nm范围内的散射光谱进行拟合对细菌体模型参数进行求解
引 言
细菌污染是水质污染的重要方面 ，为 更 好 的 保 障 饮 用 水 及生活用水的安全 ，亟 需 发 展 快 捷 、高 效 、低 成 本 的 水 体 细 菌微生物检测方法和技术 。细菌大小和菌 悬 液 浓 度 是 细 菌 检 测的重要方面 。目前 已 有 多 种 测 量 细 菌 大 小 和 数 量 的 方 法 ： 平板培养法 、概率计 数 法 、荧 光 显 微 镜 计 数 法 、免 疫 荧 光 显 微镜法 、电阻变化法 、数 字 图 像 分 析 法 等 。这 些 方 法 是 基 于 对细菌的生化特 性 检 测 ，需 要 专 业 的 人 员 操 作 ，费 时 耗 力 ， 有些需 要 荧 光 试 剂 辅 助 ， 污 染 环 境 且 不 经 济 。 流 式 细 胞 仪
１ 模型建立
的均匀微粒 ｉ ｅ散射理论 ，对 于 粒 径 分 布 为 ｆ（ Ｄ） 根据 Ｍ ［ ８］ ， 悬浮液 光密度表达式为
∞
３ 实验部分
． １ 样品和试剂 ２ ， 肺 炎 克 雷 伯 菌 大 肠 埃 希 氏 菌 （ Ｃ Ｉ Ｃ Ｃ １ ０ ３ ８ ９） ） ，购置于中国工业微生物菌种保藏中心 。 （ Ｉ Ｃ Ｃ ２ １ １ ０ ６ Ｃ 去离子水 ：电阻 １ ８ ． ２ ５ ＭΩ；无水乙醇 ：分析纯级别 ；牛 肉膏蛋白胨培养基 （ 各成 分 和 质 量 分 数 为 牛 肉 膏 ： ． ３％ ，氯 ０ 。 化钠 ： ． ５％ ，蛋白胨 ： ． ５％ ） ０ ０ ２ ． ２ 仪器 立式压力蒸汽灭菌锅 ：合肥华泰医疗 有 限 公 司 ，Ｙ Ｘ ８ ０ ２ － 型 ；恒温培养箱 ：提供 静 置 的 温 差 为 ±１ ℃ 的 恒 温 环 境 ；紫 ；低 温 高 速 离 外 －可见分光光度计 ：日 本 岛 津 公 司 （ ２ ５ ５ ０） ＵＶ 。 心机 ：江东仪器 （ ６ ５ ０ Ｒ） Ｈ－ １ ２ ． ３ 方法 ． ３ ． １ 细菌数目测量光谱 ２ 对 购买的大肠杆菌菌种进行活化 ，吸取 １ｍ Ｌ 活化菌液 ， 接种到装有 ５ ０ｍ Ｌ牛肉膏蛋白胨培养基的２ ５ ０ｍ Ｌ三角瓶 中 ，培养 １ ８ｈ 后吸取 ５ｍ Ｌ 细菌 培 养 液 于 离 心 管 中 ，转 速 为 －１ ·ｍ ，得到细菌沉淀 ，吸弃上清液 ， ，离心 １ ０ ０ ０ ０ｒ ｉ ｎ ０ｍ ｉ ｎ １ 加入 ５ｍ Ｌ 去离子水洗涤 再 次 离 心 得 到 细 菌 ，清 洗 过 程 至 少 需要三次 ，以消除培养基对细 菌 光 谱 测 量 的 影 响 。最 后 一 次 清洗之后 ，加入去离子水配制成细菌悬浮液 。 ． ３ ． ２ 不同生长时期细菌光谱 ２ 对购买的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌 菌 种 进 行 活 化 ，吸 取 １ｍ Ｌ 活化菌液 ，接种到 装 有 ５ ０ｍ Ｌ 牛肉膏蛋白胨培养基的 ２ ５ ０ｍ Ｌ 三角瓶中 ，大肠杆菌分别培养 １， ０ｈ 时 ， ３， ５， ７和１ 吸取 ５ ｍ Ｌ 细 菌 培 养 液 于 离 心 管 中 ，离 心 得 到 细 菌 悬 浮 液 ； 肺炎克雷伯菌分别培养 ２ ． ５， ４， ６， ８， １ ０ ． ５和１ ２ｈ 时 吸 取 ３ Ｌ 细菌培养液于 离 心 管 中 ，离 心 得 到 细 菌 悬 浮 液 ，方 法 同 ｍ 细菌数目测量光谱采集 。 以去离子水为参比 ，对制备的细菌悬 浮 液 进 行 紫 外 可 见 光谱 测 定 。光 谱 测 量 范 围 为 ２ ０ ０～９ ０ ０ｎ ｍ，取 样 间 隔 为 １ ｎ ｍ，扫描速度 为 中 速 。测 量 ３ 次 ，每 次 测 量 重 复 三 次 取 平 均 。光谱测量后利用平板培养法测量得到 对 应 大 肠 杆 菌 菌 悬 液的浓度 。
∞ ∞
（ ） ２ （ ） ３ （ ） ４ （ ） ５
Ｑ ｃ ａ ＝ ｓ
Ｄ， 其 中 α ＝ π ｘ） ＝ Ψｎ （ λ
槡
ｘ １（） π Ｊ ｘ ，ξ ｘ） ＝ ｎ ｎ（ ＋ ２ ２
槡
ｘ ２ １（） π １ 和Ｈ １ 分别是半整数阶 Ｂ ｅ ｓ ｓ ｅ ｌ函数和 Ｈｎ＋２ ｘ ， Ｊ ｎ ｎ ＋ ＋ ２ ２ ２ 第一类 Ｈ 中 ｍ（ 是微粒在悬浮液中的复 ａ ｎ ｋ ｅ ｌ函数 。式 （ １） λ）
折射率
ｋ（ ｎ（ ＋ｉ λ） λ） ｍ（ λ）＝ ｎ λ） ０（
（ ） ６
） 式（ 中， 和 ｋ（ 分别代表散射作用和吸收作用的实折 ６ ｎ（ λ） λ） 射率和虚折射率 ，本工作中水为悬浮介质 ， 为悬浮介质 ｎ λ） ０（
水体细菌微生物多波长散射光谱快速定量检测
王久悦 ，赵南京 ＊ ，段静波 ，孟德硕 ，方 丽 ，杨瑞芳 ， 肖 雪 ，殷高方 ，马明俊 ，刘建国 ，刘文清
安徽省环境光学监测技术重点实验室 ，中国科学院环境光学与技术重点实验室 ， 中国科学院安徽光学精密机械研究所 ，安徽 合肥 ２ ３ ０ ０ ３ １
π ｌ τ（ λ）＝ Ｎｐ ４
（∫ ）Ｑ
０
ｘ ｔ ｅ
（ ） ， （ ｍ（ Ｄ） Ｄ２ Ｄ λ） ｆＤｄ
（ ） １
其中 Ｄ 是微粒的粒径 ， ｌ 是 比 色 皿 的 厚 度 ，Ｎｐ 是 粒 子 数 目 ， ， 是微粒的消光系数 ，包含两个部分 ：吸收系数 Ｑ ｍ（ Ｄ） λ） ｘ ｔ（ ｅ 对于球形近似粒子 ，消光系数和散射系 和散射系数 Ｑ Ｑ ｂ ｓ ｃ ａ； ａ ｓ 数的计算公式选为 ２ （ （ ） ２ Ｑ ｎ＋１ ａ ｂ ｅ［ ｘ ｔ ＝ ｅ ｎ＋ ｎ） ２Ｒ ］ ∑ α ｎ＝１ ２ ２ ２ （ ） ） （ａ ２ ｎ＋１ ＋ ｂ ｎ ｎ ２ α ∑ ｎ＝１ ′ ｍ ｍ ′ －ｍ Ψ α） Ψｎ （ α） Ψｎ （ α） Ψ α） ｎ（ ｎ（ ａ ｎ ＝ ′ ｍ ｍ ′ －ｍ Ψ α） α） α） Ψｎ （ α） ｎ（ ｎ（ ｎ（ ξ ξ ′ ｍ ′ ｍ ｍ － Ψｎ （ Ψｎ （ α） Ψ α） Ψ α） α） ｎ（ ｎ（ ｂ ｎ ＝ ｍ ′ ｍ ｍ ′ － Ψｎ （ Ψ α） α） α） α） ｎ（ ｎ（ ｎ（ ξ ξ
利散射建立细胞体积与前向散射光之间 的 关 系 ，推 算 细 菌 的 体积 ；并以荧光小球作为参比 进 行 细 菌 数 量 的 计 算 。这 种 方 法检测速读较快 ，但 是 价 格 昂 贵 ，所 需 试 剂 复 杂 ，不 适 宜 现 场检测 。 紫外可见透射光谱产生于光与细胞结构和化学成分等的 直接作用 ，通过光谱分析可以反演得到细 胞 形 态 和 组 成 的 相 关信息 ，该光谱测量 技 术 具 有 无 需 反 应 试 剂 ，无 损 伤 ，测 量
，修订日期 ： ０ １ １ ２ ０ １ ５ ５ ５ ０ １ ５ ０ ８ ２ ２ － － － － 收稿日期 ：
，国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 （ ，国 家 （ 计划项目（ ５ Ｊ Ｇ Ｄ ０ ２） ６ ３） ０ １ ３ ＡＡ ０ ６ ５ ５ ０ ２， ６ １ ３ ７ ８ ０ ４ １） １ ５ ０ ８ ０ ８ ８ ２ 基金项目 ：安徽省 杰 出 青 年 科 学 基 金 项 目 （ ） 资助 ２ ０ １ ４ ＡＡ ０ ６ Ａ ５ ０ ９ ：ｗ ９ ９ ０ 年生 ，中国科学院安徽光学精密机械研究所硕士研究生 ｅ ａ ｉ ｌ ａ ｎ ｉ ｕ ｕ ｅ ｉ ｏ ｆ ｍ． ａ ｃ ． ｃ ｎ １ －ｍ ＠ａ 作者简介 ：王久悦 ，女 ， ｇ ｊ ｙ ： ａ ｉ ｌ ｎ ｚ ｈ ａ ｏ ｉ ｏ ｆ ｍ． ａ ｃ ． ｃ ｎ －ｍ ＊ 通讯联系人 ｅ ＠ａ ｊ