基因芯片、蛋白质芯片

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（二）蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein
chip)
是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反
应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统
对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
蛋白质芯片作用原理
蛋白质分子间的亲和反应
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第二节 目的基因制备rthern印迹
• 主要应用 • 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达 水平。 • 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
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三、Western印迹
• Western印迹，也称Western免疫印迹（WesternBlot或 WesternBlotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体上，然后用抗 体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程 度。 • 原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但 WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗 。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（ 例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物 学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原 ，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的 第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测 电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
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基因敲除技术
• 同源重组法
• 插入突变法 • RNAi法
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利用基因同源重组进行基因敲除
利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤 （以小鼠为例）
7
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a.基因载体的构建
把目的基因和与细胞 内靶基因特异片段同源 的DNA 分子都重组到带 有标记基因的载体上， 成为重组载体。
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b．ES 细胞的获得：
第六章 常用分子生物 学技术
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第一节 分子杂交技术
Molecular Hybridization Technique
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分子杂交
在 分子杂交技术是利用单链核酸碱基互补
配对、抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他
分子的相互作用进行目的核酸、蛋白质检测，
广泛应用于基因重组、生物印迹示踪，生物芯
片等领域。
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
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②
①
③
分子杂交实验
放 射 自 显 影 照 片
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四、原位杂交技术的原理及分类
概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测 体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进 行定位和相对定量研究的一种手段。 原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将 有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。
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分子杂交技术的分类
一. Southern 印迹
二. Northern 印迹 三. Western 印迹 四. 原位杂交 五. 生物芯片
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一、Southern印迹
• Southern印迹杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶 中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针 杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。 • • 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链 在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链 ，此杂交过程是高度特异的。
现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪， 鸡等的胚胎干细胞也有使用。
ｃ.同源重组：
将重组载体通过一定的方式导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中， 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体 中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达
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ｄ．选择筛选已击中的细胞：
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原位杂交技术的一般过程
以经过标记的已知核酸分子为探针
以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子
在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交
再对其探测
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标记
靶核酸 分子
探针 杂交 检测
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原 位 杂 交
五、生物芯片
Biological Chip
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概
念
生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支
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二、Northern印迹
• Northern印迹杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝 酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。Northern印迹杂交常用 于检测组织或细胞的基因表达水平。 • 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 • 2、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持 RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性;不能用 碱变性，防止水解。用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛变性 。 • 3、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹 时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 • 4、靶核酸为RNA • 5、探针可用DNA或RNA片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜 （e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片 目录
Southern杂交
• （一）待测核酸样品的制备 • 1、裂解或破碎细胞 • 2、抽取纯化基因组DNA • 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 • （二）待测DNA样品的电泳分离 • 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶，分离小片段用高浓度 胶 • 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子 DNA泳动快，大小 相同的分子处于同一条带 • （三）凝胶中核酸的变性（碱变化） • 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链 DNA,中 性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 • （四）Southern印迹 • 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
复制
双链cDNANA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
三、化学合成法获取目的基因
• 按照氨基酸的排列顺序，推知核酸的 核苷酸顺序，从而加以人工合成。
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化学合成法获取目的基因
持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核 酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。
芯片与标记的样品进行杂交，通过检测杂交
信号即可实现对生物样品的分析。
分类：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片
元件型微阵列、通道型微阵列、生物传感芯片
分
类
基因芯片：reverse northern - dot blots
基因芯片：检测基因突变
基因表达谱芯片：检测基因表达水平
蛋白质芯片：蛋白质在载体上的有序排列，依
据蛋白质分子、蛋白质与核酸相互作用的原理 进行杂交、检测和分析。
组织芯片：从不同的组织内进行活体解剖后取
出圆柱状的组织，然后包埋在受体区组内
（一）基因芯片
基因芯片(gene
chip)
是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排
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• 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),即PCR技术，是美国 Cetus公司人类遗传研究室的科学家 K.B.Mullis于1983年发明的一种在体 外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 。
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一、PCR技术的原理
The Principle of PCR Technology
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（a）
Southern 凝胶转 移杂交技术步骤
1.待测DNA样品的制 备、酶切 2.待测DNA 样品的电 泳分离：琼脂糖凝 胶电泳 3.凝胶中DNA的变性 ：碱变性 4.Southern转膜(印迹) 5.Southern杂交(预杂交 、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
（b）
基因组 DNA
DNA限制片段
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基因敲除简介
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
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基因敲除
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基因敲除方法及其原理
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同 源重组原理，用设计的同源片段替代靶基 因片段，从而达到基因敲除的目的。随着 基因敲除技术的发展，除了同源重组外， 新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功 的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可 以达到基因敲除的目的。
列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧
光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等 对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的 荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出 定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列
(DNA microarray)。目录ຫໍສະໝຸດ 基因芯片工作流程示意图目录
DNA芯片 技术
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（一）PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
5 5
5
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Cycle 2
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5 5
5
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Cycle 3
5 5 5 5 5 5 5 5
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5 5
5
5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
接以组织和细胞的mRNA为模板获得目 • 利用随机引物从 cDNA 或基因组中克隆 基因。目录
二、cDNAcDNA是包含某一组织细胞在一定条 件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的 cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形 式贮存着该组织细胞的基因表达信息。
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Western 印迹
• 主要步骤： • 蛋白质样品的制备 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 • 蛋白质的电转移： • 靶蛋白的免疫学检测 • 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 • 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应
• 显色反应：酶促反应
• 该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。如：检测样品 中的特异蛋白质的存在；细胞中特异蛋白质的定量分析； 蛋白质分子的相互作用研究。
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复性
RNA
DNA
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印迹技术概念
利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子 转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因
此称之为“blotting”，译为印迹技术。
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探针技术：
用放射性核素、生物素或荧光染料标记其 末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为 “探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷 酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
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Southern杂交
• （五）Southern杂交 • 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点，预杂交液为不含 DNA探针的杂交液 • 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交，双链DNA 探针需加热变性为单链，再杂交 • 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA • （六）杂交结果检测 • 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 • 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针 • 主要应用 • Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法，是研 究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物 分析等方面有重要价值。
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PCR技术原理示意图
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PCR的基本反应步骤 变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
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PCR体系基本组成成分
• 模板DNA
• 特异性引物
• 耐热DNA聚合酶
• dNTPs
• Mg2+
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（二）目的基因的克隆
• 利用特异性引物以 cDNA 或基因组 DNA 为模板获
得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。
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第三节 基因敲除技术
• 基因敲除技术的概念
• 基因敲除载体构建 • 基因敲除载体导入ES细胞 • 筛选与鉴定 • 基因敲除动物的产生
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第三节 基因敲除技术
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基因敲除简介
中文名称：基因敲除或基因剔除 英文名称：gene knock-out; gene knockout 将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。 去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或 干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个 或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的 敲除以及成段基因组序列的敲除。