纯化质粒DNA的方法[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102031258 A
(43)申请公布日 2011.04.27C N 102031258 A
*CN102031258A*
(21)申请号 201010503442.X
(22)申请日 2005.04.19
PCT/EP2004/011437 2004.09.17 EP
60/563008 2004.04.19 US
200580011784.7 2005.04.19
C12N 15/11(2006.01)
(71)申请人艾文蒂斯药品公司
地址法国安东尼
(72)发明人弗朗西斯·布兰切 迈克尔·库代尔
尼古拉斯·梅斯特拉里
蒂瑞·吉尔明 戴维·盖拉克
(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公
司 72001
代理人李进
郭文洁
(54)发明名称
纯化质粒DNA 的方法
(57)摘要
本发明提供连续的碱裂解细菌悬浮液以收集
pDNA 的方法。

它还给定了可选的附加纯化步骤，
包括裂解物过滤，阴离子交换色谱，三螺旋亲和色
谱和疏水相互作用色谱。

这些可选的纯化步骤可
以和所述连续裂解结合以提供基本上不含gDNA ，
RNA ，蛋白质，内毒素和其他污染物的高度纯化的
pDNA 产物。

(30)优先权数据
(62)分案原申请数据(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 38 页 序列表 7 页附图 4 页
1.分离自细胞的药物级质粒DNA组合物，其包含少于约0.01％的染色体DNA或基因组DNA。

2.权利要求1的药物级质粒DNA组合物，其包含少于约0.001％的染色体DNA或基因组DNA。

3.权利要求1或2的药物级质粒DNA组合物，其包含少于约0.0001％的染色体DNA或基因组DNA。

4.权利要求1-3中任一项的药物级质粒DNA组合物，其包含少于约0.00008％的染色体DNA或基因组DNA。

5.权利要求1-4中任一项的药物级质粒DNA组合物，其包含少于约0.01％的宿主细胞RNA污染物。

6.权利要求1-5中任一项的药物级质粒DNA组合物，其包含少于约0.0001％的宿主细胞蛋白质污染物。

7.权利要求1-6中任一项的药物级质粒DNA组合物，其基本上不含有可测量到的内毒素污染物。

8.权利要求7的药物级质粒DNA组合物，其含有少于0.1EU/mg的内毒素。

9.权利要求1-8中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物，包括基本上为超螺旋形式的质粒DNA。

10.权利要求1-9中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物，包括大约或多于99％的闭环形式的质粒DNA。

11.权利要求1-10中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物，其中所述质粒包括条件性复制起点。

12.权利要求1-10中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物，其中所述质粒编码成纤维细胞生长因子。

13.权利要求1-12中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物，其中所述质粒是名为NV1FGF的质粒。

纯化质粒DNA的方法
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2005年4月19日，申请号为200580011784.7(PCT/EP2005/005213)，发明名称为“纯化质粒DNA的方法”。

技术领域
[0002] 本发明涉及核酸纯化的方法。

本发明特别涉及制备高度纯化的质粒DNA(pDNA)的方法，特别涉及生产和分离药物级质粒DNA。

背景技术
[0003] 分子生物学的发展清楚地说明，基于质粒的疗法，尤其在疫苗和人类基因治疗领域中，可能支持有效的疾病治疗途径。

但是，对于该技术存在一个显著的障碍，那就是制备数量上和质量上都足以用于临床的质粒DNA。

通过质粒DNA来将正常基因安全而有效地导入人类细胞是一种有前景的方法。

质粒DNA是一种闭合环状形式的细菌DNA，其中可插入感兴趣的DNA序列。

可以导入哺乳动物细胞的感兴趣的DNA序列的例子包括外源的功能基因，或突变基因，反义序列，干扰RNA(RNAi)或双链干扰RNA(dsRNAi)，核酶(ribozymes)，例如在病毒感染，癌症或血管发生相关疾病的治疗中。

一旦导入到人类细胞中，pDNA就开始复制并产生被插入的DNA序列的拷贝。

因此，科学家们把质粒DNA看作一种有前景的载体，用于将感兴趣的DNA序列传送到人类细胞中以治疗多种疾病状态。

[0004] 为了在治疗中实施基于质粒的技术，需要极大量的质粒DNA用于研究和开发。

由于用于基因治疗和其他临床应用的质粒DNA通常是用细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)生产的，需要有效地将质粒DNA与细菌细胞的基因组DNA(gDNA)及细菌细胞的内毒素和蛋白质分离的方法。

由此，对于简单、稳健、可放大、可用来从细菌细胞中分离大量的质粒DNA的纯化方法，存在着不断增长的需求。

[0005] 在任何质粒纯化方法中都有一个重要的步骤，其包括裂解细菌细胞以释放细胞内容物，从该内容物中可分离pDNA。

事实上，首先需要实现细胞重悬、细胞裂解，及宿主污染物的中和和沉淀这三个步骤。

细胞重悬一般使用手动或磁力搅拌器，和匀浆器或转叶(impeller)混合器将细胞重悬于重悬缓冲液中。

细胞裂解可通过手工旋转或磁力搅拌来将重悬的细胞与裂解溶液(由稀碱和去污剂组成)，然后将该混合物在室温(20-25摄氏度(degrees Celsius))或冰上保持一段时间，例如5分钟，来完成裂解。

如上面指出的，手工旋转和磁力搅拌是不可放大的。

第三个步骤是宿主污染物的中和和沉淀。

第二个步骤生成的裂解物通常通过温和的旋转或磁力搅拌与冷的中和溶液混合以酸化该裂解物，然后置于冰中10-30分钟以便于高分子量的染色体DNA、宿主蛋白质和其他宿主分子变性和沉淀。

手工旋转和磁力搅拌都是不可放大的。

[0006] 通常，通过短时间溶菌酶处理，或通过碱或醋酸钾(KOAc)处理来消化细胞壁。

一般还加入RNA酶来降解细菌悬液中的RNA。

这些化学性步骤对小规模地裂解细胞可能是足够的。

但是，粘度的增加使得大规模的加工非常困难。

[0007] 一种快速而简单的质粒制备的替代方法包括用溶菌酶处理细菌，然后在合适的
缓冲液中约100℃左右煮沸20到40秒，生成不溶的基因组DNA、蛋白质和碎片的凝结块(clot)，留下质粒和作为主要污染物的RNA在溶液中。

接着，加入NaOH和十二烷基硫酸钠(SDS)来溶解细胞膜。

NaOH部分地变性DNA并部分地降解RNA；SDS起溶解膜和变性蛋白的作用。

接着，加入5N醋酸钾(pH 4.8)来沉淀SDS-蛋白质复合物和细胞碎片。

此时，pH对于中和上述操作中使用的NaOH和复性质粒都是重要的。

此后，离心除去沉淀，得到上清中的目标质粒。

但是，该技术不适合放大到高容量的细菌发酵，其原本就是用于小于5升的发酵的。

同时，这一系列的操作要求缓慢和稳定地混合以避免细菌染色体DNA被切割成小片段并聚集，使它们污染质粒，并且难以在大规模加工中实现。

[0008] 一种常用的裂解细胞的替代方法称为碱裂解(alkaline lysis)，其包括(consist of)将细菌细胞悬液(溶液1)和碱裂解溶液(溶液2)混合。

溶液2包括去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)，用于裂解细菌细胞并释放细胞内物质；和碱，例如氢氧化钠，用于使细胞的蛋白和核酸(特别是gDNA和RNA)变性。

由于细胞裂解和DNA变性，溶液的粘度急剧升高。

变性后，加入酸性溶液，例如醋酸钾(溶液3)以中和氢氧化物，导致核酸的变性。

gDNA 的长片段随机地重新结合形成网状结构，其以絮凝物的形式沉淀，并捕获蛋白，脂类及其他核酸。

十二烷基硫酸的钾盐也沉淀，并带走与其结合的蛋白。

pDNA(质粒DNA)互相缠绕的两条链正常地重新组合，恢复为初始的质粒，并保留在溶液中。

[0009] 该裂解技术是以分批的模式进行的，即，通过顺序地将不同的溶液加入容器或槽中来混合这些溶液。

由于碱裂解物是极难于操作的粘弹性流体，这种方法在混合不同溶液过程中存在困难。

由于剪应力造成gDNA片段化，片段化的gDNA极难与pDNA分离，因此需要避免对该流体施加剪应力的方法。

另外，大pDNA(即大于约10个千碱基对)也对混合过程中的剪切损伤敏感。

当含有细胞悬液的溶液与裂解溶液混合后，粘弹性的碱裂解物与中和溶液混合。

同样，由于该溶液的粘弹性性质，该混合过程也是有问题的。

[0010] 另外，放大该分批裂解方法的另一个困难包括在试图限制剪应力以避免gDNA片段化的同时混合不同流体的效率。

如前面所述的，片段化的基因组DNA的色谱行为与pDNA 非常相似，因此几乎不可能使用标准的纯化程序来去除gDNA。

由此，使用分批方法裂解细菌细胞明显地存在几方面的局限性，例如放大，片段化的gDNA污染导致回收的pDNA的质量不佳，以及所得的pDNA的量相对较低等等。

[0011] 相对于分批方法，还提出了几种使用一系列静态混合器连续地混合多种细胞裂解溶液的方法。

根据这些方法，细胞悬液和细胞裂解溶液被同时加入静态混合器。

然后，将从所述第一个静态混合器中出来的裂解细胞的溶液与沉淀溶液同时加入第二个静态混合器。

从第二个静态混合器中出来的溶液含有沉淀的裂解物和质粒。

其他裂解细胞的连续模式包括使用流过式(flow-through)热交换器，其中悬浮的细胞被加热到70-100℃。

在热交换器中裂解细胞后，对出口流进行连续流式或分批式离心，此过程中细胞碎片和基因组DNA被沉淀，留下质粒DNA在上清中。

[0012] 因此，从大容量的微生物发酵中大规模地分离和纯化质粒DNA需要开发改进的质粒制备方法。

[0013] 尽管目前有多种方法用于裂解细菌细胞，但这些方法都没有涉及流体的粘弹性质和混合步骤中牵涉的剪切力所引起的问题。

因此，本发明涉及大规模连续碱裂解细菌细胞悬液的新方法，并提供限制剪切力的重要优点。

[0014] 在任何涉及在治疗中将核酸引入人或动物的应用中，还有重要的一步，就是对大量高度纯化的、药物级的核酸的需求。

这样的纯化核酸必需满足安全性、效力(potency)和效能(efficacy)的药品质量标准。

另外，还希望有能放大的方法，可以用来生产若干克量的DNA。

因此，希望有这样的制备高纯度核酸的方法，其不需要毒性化学品，诱变剂，有机溶剂或者其他可能损害产品核酸的安全性和效力，或使放大变得困难或无法实行的试剂。

还希望能制备没有内毒素污染的核酸，内毒素施用于患者后可引发毒性反应。

当质粒DNA是从革兰氏阴性细菌来源纯化时，去除内毒素是特别重要的：革兰氏阴性细菌具有高水平的内毒素，作为其细胞外膜的必需组分。

[0015] 从细菌发酵分离和纯化质粒DNA的经典方法适用于小型或实验室规模的质粒制备。

含质粒的细菌宿主细胞破碎之后，用醋酸盐中和使得宿主细胞基因组DNA和蛋白质沉淀，并一般通过例如离心而去除。

质粒含于液相中，通过醇沉淀后，在溴化乙锭存在下使用CsCl进行等密度离心以分离各种形式，即超螺旋的，缺口环状(nicked circle)，和线性化的质粒DNA。

需要用丁醇进一步抽提以去除残余的溴化乙锭，然后用醇沉淀DNA。

接着进行其它去除宿主细胞蛋白质的纯化步骤。

[0016] 这些现有的分离质粒DNA的方法有几点局限性。

例如，涉及使用大量可燃性有机溶剂(例如乙醇或异丙醇)和有毒化学品，例如溴化乙锭、苯酚和氯仿的方法，对于大规模分离和纯化质粒DNA是不理想的。

氯化铯离心的替代方法可用于质粒DNA纯化，例如大小排阻(size exclusion)色谱，羟基磷灰石色谱和多种基于反相或阴离子交换的色谱方法。

这些替代方法可能足够用来在实验室规模产生少量的研究材料，但一般不易于放大，且不能产生质粒DNA的量。

[0017] 另外，使用化学分离方法，分离和纯化过程复杂，必须使用大量的有机溶剂，因此产生了废物处理等许多问题。

[0018] 除了化学分离纯化方法以外，还有用电泳分离质粒的方法。

电泳方法包括纸电泳和凝胶电泳，目前凝胶电泳是常用的。

但是，电泳方法具有分离时间长，收集困难，载样量小等许多问题。

[0019] 目前可用的分离两种形式的质粒DNA的方法利用离子交换色谱(Duarte et al.，Joumal of Chromatography A，606(1998)，31-45)或大小排阻色谱(Prazeres，D.M.，Biotechnology Techniques Vol.1，No.6，June1997，p 417-420)，结合使用添加剂例如聚乙二醇(PEG)、去污剂和其他组分例如六胺钴(hexamine cobalt)，精胺和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

但是，现在已知的方法不能充分地且节约成本地分离超螺旋和缺口(或松环(relaxed))DNA。

而且很多已知方法都有一个缺点：其使用PEG或其他添加剂，这在质粒DNA 生产中是不希望的，因为它们需要额外的分离、处置和质量控制方法，这可能是困难的，且耗费更多的时间和成本。

这些已知的分离超螺旋和松环形式的质粒DNA的方法的替代形式使用非常昂贵的树脂，而且加工中还使用溶剂，例如乙腈，乙醇，和其他组分，例如三乙胺和四丁基磷酸铵。

其他分离超螺旋和松环DNA的方法依靠大小排阻色谱，其涉及基于两种形式的质粒DNA在大小上的细微差异来分离二者。

这些色谱柱倾向于较长，从而导致显著的放大问题，使其难以实用于大规模生产。

而且，大小排阻方法需要浓的样品溶液，由于DNA 的高度粘性，这对质粒DNA溶液是难以实现的。

[0020] 从细菌制备物生产的、经常含有松环和超螺旋质粒DNA的质粒DNA制备物，经常需
要去除内毒素，如FDA所要求的，因为已知许多细菌宿主产生的内毒素会在接受该质粒DNA 的宿主中引起炎症反应，例如发热或败血病。

这些内毒素一般是脂多糖或其片段，存在于宿主细胞和宿主细胞膜或大分子的制备物中。

因此，在用于治疗或预防的质粒DNA的纯化中内毒素的去除是关键和必要的步骤。

从质粒DNA溶液中去除内毒素主要利用内毒素带负电的结构。

但是，质粒DNA也是带负电的，所以通常纯化是这样实现的：使用同时结合这两种分子的阴离子交换树脂，并在一定的条件下，优选地洗脱质粒DNA而结合内毒素。

这样的分离只能实现部分的去除，因为有相当量的内毒素和质粒DNA一起被洗脱，而且/或者，质粒DNA的回收率很低。

[0021] 因此，为了从大容量微生物发酵大规模分离和纯化质粒DNA，需要开发更好的质粒制备方法。

同时，也需要一种更简单、更省时地分离和纯化大量质粒DNA的方法。

对于基于质粒的研究和治疗方法而言，还希望核酸的分离和纯化能保持核酸相同的结构，并以可重复的方式进行，而且，为了避免杂质对哺乳动物身体的不良影响，要求核酸已经被分离纯化达到高纯度。

[0022] 但是，使用常规方法存在这样的问题：不能获得足够高的纯度和足够大的量的核酸，尤其是质粒。

因此，本发明旨在提供一种使用至少两个色谱步骤的分离方法，其使得在更短的时间内分离大量的质粒DNA成为可能，且达到未预料到的高纯度等级。

[0023] 发明概述
[0024] 本发明基于产生和分离高度纯化的质粒DNA的方法的发现。

根据本发明的发明产生和分离的质粒DNA含有非常低水平的污染性染色体DNA，RNA，蛋白质和内毒素。

根据本发明生产的质粒DNA具有足以用于基于质粒的治疗的纯度。

[0025] 因此，本发明包括产生和分离高度纯化的质粒DNA的方法，包括细胞裂解步骤，该步骤中存在(a)湍流装置(a means for turbulent flow)，用于快速地混合细胞悬液和溶解该细胞的溶液；和(b)层流装置(ameans for laminar)，其使得(a)中产生的混合物可以在不受到显著扰动的条件下温育，其中(a)中形成的混合物从所述湍流装置流入所述层流装置。

[0026] 在本发明的一个进一步的实施方式中，所述机构还包括加入第二溶液的装置，所述第二溶液中和裂解溶液；其中(b)中温育的混合物从所述层流装置流入该加入第二溶液的装置。

[0027] 在另一个实施方式中，该机构可用于从细胞中分离质粒DNA的方法，该方法包括(a)在所述湍流装置中将细胞与碱性裂解溶液混合；和(b)加入酸性溶液来中和所述碱性裂解溶液。

[0028] 本发明还涉及连续细胞碱裂解装置，包括：第一混合器或注射器，其可以与细胞悬液相反的方向注射碱性流体，小直径的第一管，以在所述混合物中产生湍流；大直径的第二管，以在所述混合物中产生层流；和第二混合器或注射器，用于将在一端注射中和溶液和收集裂解物。

[0029] 本发明进一步包括生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法，所述质粒DNA基本上(essentially)不含污染物，因此是药物级的DNA。

[0030] 本发明的另一个目的是涉及分离和纯化核酸和质粒DNA的方法。

更详细地说，本发明涉及分离核酸和质粒DNA的方法，所述核酸和质粒DNA为药品级，可用于研究和基于质
粒的治疗方法。

根据本发明的方法分离的质粒DNA制备物可经历纯化步骤，其至少包含三螺旋色谱(triple helix chromatography)还可进一步包含阴离子交换色谱和疏水相互作用色谱。

[0031] 因此这些方法包括本文所描述的连续碱裂解步骤及后续阴离子交换色谱和/或三螺旋亲和色谱和/或进一步疏水相互作用色谱的组合。

[0032] 因此这些方法还包括此处描述的连续碱裂解步骤，其与随后的步骤组合，阴离子交换色谱，三螺旋色谱，和与疏水性相互作用色谱的组合。

裂解物的过滤或其它絮凝物去除先于第一色谱步骤。

[0033] 本发明的一个目的是使从宿主细胞/质粒DNA组合中制备质粒DNA的产量最大化。

[0034] 本发明的另一个目的是提供基本上不含细菌宿主RNA的质粒DNA制备物。

[0035] 本发明的另一个目的是提供基本上不含细菌宿主蛋白质的质粒DNA制备物。

[0036] 进一步地，本发明的另一个目的是提供基本上不含细菌宿主染色体DNA的质粒DNA制备物。

[0037] 本发明的另一个目的是提供基本上不含细菌宿主内毒素的质粒DNA制备物。

[0038] 本发明的另一个目的是提供制备药物级质粒DNA的方法，所述质粒DNA是高度纯化的，用于研究和基于质粒的治疗方法，并且其适于放大到大规模生产。

[0039] 因此本发明包括基本不含污染物、高纯度且完整的药物级质粒DNA，该DNA包括载体骨架，治疗基因和相关的调控序列。

[0040] 本发明还涉及质粒DNA液体制剂，该制剂是稳定的，在室温下长期保持不降解，因此适用于保存用于研究和相关人类治疗方法的质粒DNA。

[0041] 本发明的其他目的和优点，一部分在下面的描述部分中提出，一部分可以根据该描述而显然自明，或在本发明的实施中得知。

本发明的目标和优点可以借助所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和达到。

[0042] 要理解的是前面的一般性描述和下面的详细描述都仅仅是例示性和解释性的，而并非限制本发明，如所声称的那样。

[0043] 被引入并作为本说明书的一部分的附图说明了数个本发明的实施方式，并且与描述部分一起起到解释本发明的原则的作用。

附图说明
[0044] 图1是可用于本发明的连续式细胞裂解的装置的示意图。

[0045] 图2是上述连续细胞裂解装置的混合器M1的示意图。

[0046] 图3是比较三种纯化方法以gDNA、RNA、蛋白质、内毒素污染物为指标的纯化产率的表，三种方法分别为：单步的阴离子交换色谱(AEC)；阴离子交换色谱步骤和三螺旋亲和色谱步骤(THAC)组合的两步法；和包括阴离子交换色谱步骤、三螺旋亲和色谱步骤和疏水相互作用色谱的组合的三步法；ND表示未检测到：低灵敏度的分析方法。

[0047] 图4是多种分离纯化质粒DNA方法，例如单独使用或组合使用的阴离子交换色谱(AEC)、羟基磷灰石色谱(HAC)，疏水相互作用色谱(HIC)，反相色谱(RPC)，大小排阻色谱(SEC)和三螺旋亲和色谱(THAC)，与本发明的方法的比较。

这里提供了以纯化的质粒DNA
的质量为指标的结果。

ND表示未检测到(低灵敏度的分析方法)。

[0048] 图5A和5B是显示质粒DNA在+25℃和+5℃贮存到90天的脱嘌呤和缺口率(形成开环形式的质粒)的图。

[0049] 定义
[0050] “酸性”表示与酸相关或含有酸，具有小于7的pH。

[0051] “碱性”表示与碱(alkali或base)相关或含有碱，具有大于7的pH。

[0052] “连续”表示不被间断，没有间断。

[0053] “基因组DNA”表示来自或存在于染色体的DNA。

[0054] “层流”表示溶液水流中的一种流动形式，其中各个颗粒在与每个颗粒平行的方向上流动。

[0055] “裂解物”表示由细胞裂解过程产生的物质。

术语“裂解”指通过使用含有裂解剂的溶液进行化学处理，使处于缓冲溶液中的细胞(即细胞悬液)的细胞壁和/或细胞膜破裂的作用。

裂解剂包括，例如，碱、去污剂、有机溶剂和酶。

在一个优选的实施方式中，进行细胞裂解以从宿主细胞中释放完整的质粒。

[0056] “中和”指使(溶液)称为中性或使(酸或碱(base/alkali))受到中和作用。

我们用这个术语指中和溶液的某个物质将该溶液的pH变为pH5-7，优选为7左右，更优选比先前更靠近7。

[0057] “牛顿流体”(newtonian fluid)指这样的流体，其中剪应力与速度梯度成比例并垂直于剪切面。

比例常数被称为粘度。

牛顿流体的例子包括液体和气体。

[0058] “非牛顿流体”(Non-newtonian fluid)指这样的流体，其中剪应力不仅仅与速度梯度成比例并垂直于剪切面。

非牛顿流体可能不具有确定的粘度。

非牛顿流体包括塑性固体(plastic solids)，幂律流体(power-law fluids)，粘弹性流体(viscoelastic fluids) (兼具粘性和弹性)，和时变粘度流体(time-dependent viscosity fuids)。

[0059] “质粒DNA”指一类由非染色体的环状DNA组成的小的细胞内含物，其可能具有让非内源的DNA片段插入自身的能力。

如本文中所使用的，质粒DNA也可以是质粒DNA的任何形式，例如被切割、加工或其他被操作过的形式的非染色体DNA，包括，例如，下列的任一个或任意组合：缺口环状(nicked circle)质粒DNA，线性化的或线性的(linearized orlinear)质粒DNA，和单链质粒DNA。

构建质粒的程序包括如Maniatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中所描述的那些。

本领域中熟知的一种小量制备质粒DNA的操作规程(Bimboim and Doly，Nucleic Acids Research 7：1513(1979))可以用来初步分离质粒DNA，以供后面通过本发明的某些方面来加工，并且可以和本发明的方法所生产的高度纯化样品作比较。

优选地，该质粒DNA 的形式是，或至少在用本发明的纯化方法制备后是，基本上闭合环状形式的质粒DNA，或大约80％，85％，90％，95％，或高于大约99％为闭合环状形式的质粒DNA。

或者，超螺旋共价闭合形式的pDNA(ccc)在某些治疗方法中可能是优选的，在该方法中其可能比开环，线性或其他多种形式更为有效。

因此，所述药物级质粒DNA可以从一种或多种形式的质粒分离或纯化，并且可包含一种或多种希望的形式。

[0060] 对本发明而言，术语“流动”(flowing)指使液体以一定的流速(例如升每分钟)通过混合器，通常通过泵的作用。

需要指出，通过混合器的流速被认为影响裂解、沉淀和混
合的效率。

[0061] 术语“缺口的”(nicked)和“松环的”(relaxed)指非超螺旋的DNA。

“超螺旋的”(supercoiled)DNA是本领域熟知的用于描述特定的分离的质粒DNA形式的术语。

质粒DNA的其他形式在本领域中也是已知。

[0062] “污染性杂质”(contaminating impunty)指希望将DNA与其分开或从其分离的任何物质。

污染性杂质包括但不限于，宿主细胞蛋白质；内毒素；宿主细胞DNA，例如染色体DNA或基因组DNA；和/或宿主细胞RNA。

如人们所理解的，什么是污染性杂质，或者可以认为是污染性杂质，可能取决于实施本发明的方法的具体条件。

“污染性杂质”可能是或不是来自宿主细胞的，即，其可以是也可以不是宿主细胞杂质。

[0063] “分离”或“纯化”第一组分(例如DNA)指将该第一组分从最初与其一起的其他组分中富集出来。

本文提供了所希望的和/或所能达到的纯化程度。

[0064] 术语“基本上不含有”(essentially free)和“高度纯化的”(highlypurified)定义为大约95％，和优选地大于98.88％纯或不含污染物，或含有少于5％，和优选地少于1-2％的污染物。

[0065] “药物级DNA”(pharmaceutical grade DNA)在本文中定义为这样的DNA制备物，其含有不多于约5％，和优选地不多于大约1-2％的细胞组分，例如细胞膜。

[0066] 本发明进一步包括生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法，该质粒DNA基本上不含污染物，因此是药物级的DNA。

通过本发明的方法生产和分离的质粒DNA含有极低水平，即百万分率(ppm，parts permillion)的污染性染色体DNA、RNA、蛋白质和内毒素，且主要地含有闭合环状形式的质粒DNA。

根据本发明生产的质粒DNA具有足够的纯度用于研究和基于质粒的治疗方法及可选地用于人类临床试验材料和人类基因治疗试验和临床试验。

[0067] 本发明的“药物级质粒DNA组合物”是指用本发明的方法生产的药物级质粒DNA组合物，和/或这样的组合物，其至少具有一种被如下定义为“药物级质粒DNA”的纯度水平。

优选地，本发明的“药物级质粒DNA组合物”具有这样的纯度水平，其按照至少两种如下文提出的标准被定义为“药物级质粒DNA”，例如，少于约0.00008％的染色体或基因组DNA和少于约0.00005％的蛋白质污染物，或例如少于约0.00008％的染色体或基因组DNA和少于约0.1EU/mg的内毒素。

其他纯度水平的组合也包括在该定义之下。

当然，所述药物级质粒DNA组合物还可以包括或包含添加的组分，其可用于任何特定用途，包括用于组合治疗，组合物和疗法。

染色体或基因组DNA，RNA，内毒素或蛋白质指来自基于细胞的质粒生产的污染物或来自纯化过程中的其他污染物。

[0068] 如指出的，“药物级质粒DNA”定义为这样的DNA制备物，其包含百万分之一份或1ppm(＜0.0001％，即，＜0.0001mg每100mg质粒DNA)水平的，或更少的基因组DNA，RNA 和/或蛋白质污染物。

[0069] 同时，或更准确地，“药物级质粒DNA”在本文中可以指这样的DNA制备物，其含有少于约0.01％，或少于0.001％，且优选地少于0.0001％，或优选地少于0.00008％(＜0.00008％，即＜0.00008mg每100mg质粒DNA)的染色体DNA或基因组DNA。

[0070] “药物级质粒DNA”还可以指这样的DNA制备物，其含有少于约0.01％，或少于0.001％，并优选地少于0.0001％，或优选地少于0.00002％(＜0.00002％，即＜0.00002mg每100mg质粒DNA)的RNA污染物。