环境中微生物的检测资料
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第六章 环境中微生物的检测
第一节 水体中的微生物
一、水体是微生物的天然生境 无论是海水还是淡水水体中，都有着微生物生长所必需
的营养，有着土壤所具备的条件。
二、水体中微生物的数量和分布 1. 污染淡水
处于城镇等人口聚集地区的湖泊、河流等淡水。 108~109个/mL水 主要是一些能分解各种有机物的腐生菌，如芽孢杆菌、 生孢梭菌、变形杆菌、大肠杆菌、粪链球菌等。有的甚至还 含有伤寒、痢疾、霍乱、肝炎等人类病原菌。
1mL
每个稀释度
做两个平皿
1mL
1mL
1mL
倾注平皿
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿 约15ml，并转动平皿，混合均匀。
3、培养及计数
培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h
计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放 置于0－4℃，但不得超过24h。
计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀 释度的各平板平均菌落数。
10-2
10-3
两个稀释度 菌落数(个 报告方式(个
菌落数之比 /mL)
/mL)
1 1365 2 2760
164
20
—
295
46
1.6
16400 1.6×104 37750 3.8×104
3 2890 4 无法计数 5 27 6 无法计数 7 无法计数
271
60
2.2
4650
513
—
11
5
—
305
12
—
无法计数 无法计数
27100 2.7×104 513000 5.1×105
270 2.7×102 30500 3.1×104
10-3无法计数
计数原则：选平均菌落数在30~300之间者进行计算
1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报 告之。
2.若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决 定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。
红色、粉红色菌落。 抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。
2、计算方法
MPN＝
1000×为阳性结果的发酵管（瓶）的数目
为阴性结果的水样体积（mL）×全部水样体积（mL）
练 习：
如对一自来水厂出水进行检验，初发酵一般在10支小发酵管和两 支大发酵瓶内进行，复发酵在5支小发酵管内进行。以300mL进 行初发酵实验，其中100mL的水样2份（分状于2个大发酵瓶中）， 10mL 水 样 10 份 ， （ 分 状 于 10 支 个 小 发 酵 管 中 ） 。 实 验 结 果 ： 100mL的2份水样为阴性结果，无大肠杆菌存在；10mL的水样中 有5份为阳性结果，存在大肠杆菌。则：
C 1000 50N At
• 式中：C——空气细菌数；（个/m3） N——菌落数（个）； A——平皿底面积（㎝2）； t――暴露时间（min）。
• 目前，我国还没有统一的空气卫生标准，一般以 室内1m3空气中细菌总数在500～1000以上作为污 染指标。
Ⅰ≤200 Ⅱ≤2000 Ⅲ≤10000 Ⅳ≤20000 Ⅴ≤40000
Ⅰ～Ⅲ≤100 Ⅳ≤1000 Ⅴ﹥1000
Ⅰ～Ⅲ≤3 Ⅳ≤100 Ⅴ﹥100
A类≤10000 A类≤2000
粪大肠菌群(个/L) ≤10000
总大肠菌群(个/L) 总大肠菌群(个/L)
≤5000 ≤500（贝类养殖水质）
≤10000 ≤700（贝类养殖水质）
3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍 数报告之。
4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。
5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。
6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。 7.在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜 采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约
取产酸产气的发酵管 中培养液在伊红美兰 平板上进行划线
取有核心和带金 属光泽的深紫色 菌落进行革兰氏 染色
镜检（革兰氏阴性菌）
37℃ 培养24h
证实产气 （阳性） 结果与否
乳糖蛋白胨培养液
大肠菌群测定
产酸判断：紫色培养液变成黄色 产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁
上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；
农业灌溉水质标准 GB5084-92
渔业水质标准 GB11607-89
海水水质标准 GB3097-1997
项目 细菌总数(个/mL) 总大肠菌群(个/L)
总大肠菌群(个/L)
粪大肠菌群(个/L)
细菌总数(个/mL) 总大肠菌群(个/L)
总大肠菌群(个/L) 粪大肠菌群(个/L)
标准值
≤100
≤3
一级≤1000 二级≤10000
面吹起的水滴、生物体体表脱落的物质、人和动物的 排泄物等。
二、空气中微生物的数量和分布
空气中的微生物大部分是腐生的种类，但是不同的空气 环境中微生物的种类不同。有些种类是普遍存在的，如某些 霉菌、酵母菌、真菌孢子。细菌主要是来自于土壤的腐生性 种类，常见的为各种球菌、芽孢杆菌、产色素细菌等。
空气中微生物的分布随环境条件及微生物的抵抗力不同 而呈现不同的分布规律。空气中微生物的数目决定于尘埃的 总量。空气中尘埃含量越高，微生物的种类数量越多。
石油岩石地下水含分解烃的细菌，含铁泉水有铁细菌，含 硫温泉有硫磺细菌。
3. 影响微生物在淡水水体中分布的因素 水体类型、污染程度、有机物的含量、溶解氧量、水温、
pH及水深等。 4. 海水
除了一些从河水、雨水及污水等带来的临时种类外，绝 大多数是耐盐、嗜冷、耐高渗透压和耐高静水压力的种类。 海水中常见的微生物有假单胞菌属、弧菌属、黄色杆菌属、 无色杆菌属及芽孢杆菌属等。
固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单 位报告，表面涂擦则以菌群测定 ——国家标准采用三步法
大肠菌群 ——需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革
兰氏阴性无芽胞杆菌。
1、检验查表方法
乳糖发酵试验
分离培养
样品稀释后，选 择三个稀释度， 每个稀释度接种 三管乳糖胆盐发 酵管。36±1℃培 养48±2h，观察 是否产气。
较清洁样品的三步法图示
100mL 100mL
10mL
10mL 10mL 10mL
水样
10mL 10mL
10mL 10mL
10mL 10mL
50mL三倍浓缩乳 糖蛋白胨培养液
5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL
三步法图示
37℃ 培养48h 37℃培养24h
MPN＝ =
1000×为阳性结果的发酵管（瓶）的数目 为阴性结果的水样体积（mL）×全部水样体积（mL）
1000 ×5
250（mL）×300（mL）
第二节 空气中的微生物
空气的生态条件——不适合微生物生长繁殖。（营 养不足、紫外线照射、水分少）。
一、空气微生物的来源 空气中的微生物主要来自土壤飞起来的灰尘、水
为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，
然后乘以2作为整个平板的菌落数。
4、菌落总数报告方式
菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实 有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数 按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。
将产气发酵管培
养物转种于伊红
美蓝琼脂平板上， 36±1℃培养1824h，观察菌落形 态。
证实试验
挑取平板上的可 疑菌落，进行革 兰氏染色观察。 同时接种乳糖发 酵管36±1℃培养 24±2h，观察产 气情况。
根据证实为 大肠杆菌阳 性的管数， 查MPN表， 报告每 100ml（g） 大肠菌群的 MPN值。
一般在港口，每毫升海水含菌量为1×105个，在外海每
毫升含菌为10~250个。
各种用途的水质标准
标准名称及标准编号
生活饮用水卫生标准 GB5749-85
生活饮用水源水质标准 CJ3020-93
地表水环境质量标准 GB3838-2002
地下水质量标准 GB/T14848-93
景观娱乐用水水质标准 GB12941-91
1ml
含有玻璃珠的灭
1ml
菌玻璃瓶或乳钵
1：10稀释液。 1ml
9ml稀释液 1：100
操作要求：“无菌操作”贯彻始终。
9ml稀释液 1：1000
9ml稀释液 1：10000
环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；
液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
表4-2 不同条件下1m3空气的含菌量
条件 畜舍 宿舍 城市街道 市区公园 海洋上空 北极（北纬80o）
数量 1~2×106 20000 5000 200 1~2 0
三、空气微生物的卫生标准 室内空气污染的指标：＞500～1000个/m3。
清洁程度
细菌总数 （个/m3）
清洁程度
细菌总数 （个/m3）
三、水的细菌学检测 （一） 细菌总数测定
菌落总数——需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板 上生长的细菌菌落总数.
作用：判定水体被细菌污染的程度
基本操作一般包括： 样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
1、样品的处理和稀释
25g或25ml 检样
充分振摇或研磨
225mL稀释液
最清洁空气 1～2
临界环境 ～150
清洁空气 <30
轻度污染 <300
普通空气 31～125
严重污染 >301
四、空气中微生物的检测方法
• 常用的检验方法是沉降平板法，即测定在一定时间内 从空气中降落到单位面积地面上的微生物个数。操作 过程如下：
• 将融化的营养琼脂培养基倒入d90mm无菌培养皿中制成 平板。均匀布设在待测处地板上（一般最少设5个待测 点），打开皿盖5～10min，让空气中的微生物降落在 平板表面，盖好皿盖，然后倒置放入培养箱中，在 37℃条件下培养48h后计菌落数。
减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。
1.取样 25g或25ml
检样
2、稀释样品的取样和倾注平皿
1mL
1mL
1ml无菌水
1：10稀释液
225mL无菌水
1mL
9mL稀释液 1：100
1mL
9mL稀释液 1：1000
规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落 数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈 多。 如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现 象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。
报告原则
例
不同稀释度的平均菌落数
次 10-1
2. 清洁淡水 （1）溪流及贫营养湖
10~100个/mL水 以自养型种类为主。常见细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝 细菌、柄细菌、赭色纤发菌、球衣菌和萤光假单胞菌等。此 外，还有许多藻类（如绿藻、硅藻等）、原生动物（如钟虫 及其他固着型纤毛虫、变形虫、鞭毛虫等）和后生动物（如 枝角类、桡足类等）。
（2）地下水、自流井、山泉及温泉 有机物和微生物都很少
第一节 水体中的微生物
一、水体是微生物的天然生境 无论是海水还是淡水水体中，都有着微生物生长所必需
的营养，有着土壤所具备的条件。
二、水体中微生物的数量和分布 1. 污染淡水
处于城镇等人口聚集地区的湖泊、河流等淡水。 108~109个/mL水 主要是一些能分解各种有机物的腐生菌，如芽孢杆菌、 生孢梭菌、变形杆菌、大肠杆菌、粪链球菌等。有的甚至还 含有伤寒、痢疾、霍乱、肝炎等人类病原菌。
1mL
每个稀释度
做两个平皿
1mL
1mL
1mL
倾注平皿
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿 约15ml，并转动平皿，混合均匀。
3、培养及计数
培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h
计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放 置于0－4℃，但不得超过24h。
计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀 释度的各平板平均菌落数。
10-2
10-3
两个稀释度 菌落数(个 报告方式(个
菌落数之比 /mL)
/mL)
1 1365 2 2760
164
20
—
295
46
1.6
16400 1.6×104 37750 3.8×104
3 2890 4 无法计数 5 27 6 无法计数 7 无法计数
271
60
2.2
4650
513
—
11
5
—
305
12
—
无法计数 无法计数
27100 2.7×104 513000 5.1×105
270 2.7×102 30500 3.1×104
10-3无法计数
计数原则：选平均菌落数在30~300之间者进行计算
1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报 告之。
2.若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决 定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。
红色、粉红色菌落。 抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。
2、计算方法
MPN＝
1000×为阳性结果的发酵管（瓶）的数目
为阴性结果的水样体积（mL）×全部水样体积（mL）
练 习：
如对一自来水厂出水进行检验，初发酵一般在10支小发酵管和两 支大发酵瓶内进行，复发酵在5支小发酵管内进行。以300mL进 行初发酵实验，其中100mL的水样2份（分状于2个大发酵瓶中）， 10mL 水 样 10 份 ， （ 分 状 于 10 支 个 小 发 酵 管 中 ） 。 实 验 结 果 ： 100mL的2份水样为阴性结果，无大肠杆菌存在；10mL的水样中 有5份为阳性结果，存在大肠杆菌。则：
C 1000 50N At
• 式中：C——空气细菌数；（个/m3） N——菌落数（个）； A——平皿底面积（㎝2）； t――暴露时间（min）。
• 目前，我国还没有统一的空气卫生标准，一般以 室内1m3空气中细菌总数在500～1000以上作为污 染指标。
Ⅰ≤200 Ⅱ≤2000 Ⅲ≤10000 Ⅳ≤20000 Ⅴ≤40000
Ⅰ～Ⅲ≤100 Ⅳ≤1000 Ⅴ﹥1000
Ⅰ～Ⅲ≤3 Ⅳ≤100 Ⅴ﹥100
A类≤10000 A类≤2000
粪大肠菌群(个/L) ≤10000
总大肠菌群(个/L) 总大肠菌群(个/L)
≤5000 ≤500（贝类养殖水质）
≤10000 ≤700（贝类养殖水质）
3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍 数报告之。
4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。
5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。
6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。 7.在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜 采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约
取产酸产气的发酵管 中培养液在伊红美兰 平板上进行划线
取有核心和带金 属光泽的深紫色 菌落进行革兰氏 染色
镜检（革兰氏阴性菌）
37℃ 培养24h
证实产气 （阳性） 结果与否
乳糖蛋白胨培养液
大肠菌群测定
产酸判断：紫色培养液变成黄色 产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁
上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；
农业灌溉水质标准 GB5084-92
渔业水质标准 GB11607-89
海水水质标准 GB3097-1997
项目 细菌总数(个/mL) 总大肠菌群(个/L)
总大肠菌群(个/L)
粪大肠菌群(个/L)
细菌总数(个/mL) 总大肠菌群(个/L)
总大肠菌群(个/L) 粪大肠菌群(个/L)
标准值
≤100
≤3
一级≤1000 二级≤10000
面吹起的水滴、生物体体表脱落的物质、人和动物的 排泄物等。
二、空气中微生物的数量和分布
空气中的微生物大部分是腐生的种类，但是不同的空气 环境中微生物的种类不同。有些种类是普遍存在的，如某些 霉菌、酵母菌、真菌孢子。细菌主要是来自于土壤的腐生性 种类，常见的为各种球菌、芽孢杆菌、产色素细菌等。
空气中微生物的分布随环境条件及微生物的抵抗力不同 而呈现不同的分布规律。空气中微生物的数目决定于尘埃的 总量。空气中尘埃含量越高，微生物的种类数量越多。
石油岩石地下水含分解烃的细菌，含铁泉水有铁细菌，含 硫温泉有硫磺细菌。
3. 影响微生物在淡水水体中分布的因素 水体类型、污染程度、有机物的含量、溶解氧量、水温、
pH及水深等。 4. 海水
除了一些从河水、雨水及污水等带来的临时种类外，绝 大多数是耐盐、嗜冷、耐高渗透压和耐高静水压力的种类。 海水中常见的微生物有假单胞菌属、弧菌属、黄色杆菌属、 无色杆菌属及芽孢杆菌属等。
固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单 位报告，表面涂擦则以菌群测定 ——国家标准采用三步法
大肠菌群 ——需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革
兰氏阴性无芽胞杆菌。
1、检验查表方法
乳糖发酵试验
分离培养
样品稀释后，选 择三个稀释度， 每个稀释度接种 三管乳糖胆盐发 酵管。36±1℃培 养48±2h，观察 是否产气。
较清洁样品的三步法图示
100mL 100mL
10mL
10mL 10mL 10mL
水样
10mL 10mL
10mL 10mL
10mL 10mL
50mL三倍浓缩乳 糖蛋白胨培养液
5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL
三步法图示
37℃ 培养48h 37℃培养24h
MPN＝ =
1000×为阳性结果的发酵管（瓶）的数目 为阴性结果的水样体积（mL）×全部水样体积（mL）
1000 ×5
250（mL）×300（mL）
第二节 空气中的微生物
空气的生态条件——不适合微生物生长繁殖。（营 养不足、紫外线照射、水分少）。
一、空气微生物的来源 空气中的微生物主要来自土壤飞起来的灰尘、水
为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，
然后乘以2作为整个平板的菌落数。
4、菌落总数报告方式
菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实 有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数 按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。
将产气发酵管培
养物转种于伊红
美蓝琼脂平板上， 36±1℃培养1824h，观察菌落形 态。
证实试验
挑取平板上的可 疑菌落，进行革 兰氏染色观察。 同时接种乳糖发 酵管36±1℃培养 24±2h，观察产 气情况。
根据证实为 大肠杆菌阳 性的管数， 查MPN表， 报告每 100ml（g） 大肠菌群的 MPN值。
一般在港口，每毫升海水含菌量为1×105个，在外海每
毫升含菌为10~250个。
各种用途的水质标准
标准名称及标准编号
生活饮用水卫生标准 GB5749-85
生活饮用水源水质标准 CJ3020-93
地表水环境质量标准 GB3838-2002
地下水质量标准 GB/T14848-93
景观娱乐用水水质标准 GB12941-91
1ml
含有玻璃珠的灭
1ml
菌玻璃瓶或乳钵
1：10稀释液。 1ml
9ml稀释液 1：100
操作要求：“无菌操作”贯彻始终。
9ml稀释液 1：1000
9ml稀释液 1：10000
环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；
液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
表4-2 不同条件下1m3空气的含菌量
条件 畜舍 宿舍 城市街道 市区公园 海洋上空 北极（北纬80o）
数量 1~2×106 20000 5000 200 1~2 0
三、空气微生物的卫生标准 室内空气污染的指标：＞500～1000个/m3。
清洁程度
细菌总数 （个/m3）
清洁程度
细菌总数 （个/m3）
三、水的细菌学检测 （一） 细菌总数测定
菌落总数——需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板 上生长的细菌菌落总数.
作用：判定水体被细菌污染的程度
基本操作一般包括： 样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
1、样品的处理和稀释
25g或25ml 检样
充分振摇或研磨
225mL稀释液
最清洁空气 1～2
临界环境 ～150
清洁空气 <30
轻度污染 <300
普通空气 31～125
严重污染 >301
四、空气中微生物的检测方法
• 常用的检验方法是沉降平板法，即测定在一定时间内 从空气中降落到单位面积地面上的微生物个数。操作 过程如下：
• 将融化的营养琼脂培养基倒入d90mm无菌培养皿中制成 平板。均匀布设在待测处地板上（一般最少设5个待测 点），打开皿盖5～10min，让空气中的微生物降落在 平板表面，盖好皿盖，然后倒置放入培养箱中，在 37℃条件下培养48h后计菌落数。
减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。
1.取样 25g或25ml
检样
2、稀释样品的取样和倾注平皿
1mL
1mL
1ml无菌水
1：10稀释液
225mL无菌水
1mL
9mL稀释液 1：100
1mL
9mL稀释液 1：1000
规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落 数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈 多。 如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现 象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。
报告原则
例
不同稀释度的平均菌落数
次 10-1
2. 清洁淡水 （1）溪流及贫营养湖
10~100个/mL水 以自养型种类为主。常见细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝 细菌、柄细菌、赭色纤发菌、球衣菌和萤光假单胞菌等。此 外，还有许多藻类（如绿藻、硅藻等）、原生动物（如钟虫 及其他固着型纤毛虫、变形虫、鞭毛虫等）和后生动物（如 枝角类、桡足类等）。
（2）地下水、自流井、山泉及温泉 有机物和微生物都很少