生鲜牛奶中牛分支杆菌PCR检测方法的建立

支 杆菌 Ｐ Ｃ Ｒ检测方 法 。
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
１ ． １ ． １ 菌株
冻干 粉 卡介 苗 （ Ｂ Ｃ Ｇ）来 自兰州 生 物
制 品研 究 所 ， 置一２ ０℃ 保存 ； 沙 门菌 （ Ｓ ａ ｌ ｍｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ａ ） 、 大肠 埃希 菌 （ Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ ） 、 无乳 链 球 菌 （ Ｓ ．ａ ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ａ ｅ ） 、 金黄 色 葡萄 球 菌 （ Ｓ ． ａ ｕ ｒ ｅ ｕ ｓ ） 、 嗜肺 巴 氏杆 菌 （ Ｐ．
摘 要 ： 为建 立 生鲜 牛奶 中牛 分 支杆 菌的 Ｐ Ｃ Ｒ检测方法， 选 择 牛分 支杆 菌 ｐ ｎ ｃ Ａ 的基 因序 列 中一段 大
小为 ４ ２ ３ ｂ ｐ的 片段 作 为 靶 序 列 ， 设计 并合 成一 对 引物 ， 对所 建 立 的 Ｐ Ｃ Ｒ 方 法进 行 了特 异性 、 敏 感 性 和 重 复
检测 ， 根据 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ发布 的 牛分 支 杆 菌 大不 列 颠 强
毒株 （ ＡＦ ２ １ ２ ２ ／ ９ ７ ） 和卡 介苗 （ Ｂ Ｃ Ｇ） 弱 毒 株 的全 基 因 序列， 对 二者 进行 对 比， 发 现它 们 的 ｐ ｎ ｃ Ａ 序列 完 全
一
致， 所 以用 Ｂ Ｃ Ｇ弱毒株为参考菌株 ， 建 立 了牛 分
胜试 验 。结 果表 明 ， 建立的 Ｐ Ｃ Ｒ 方法在 牛 分 支杆 菌污染模 型 乳 中成 功 扩增 出了 ４ ２ ３ ｂ ｐ的特 异 性 目的 条 带 ，
而分别 添加 有 沙 门菌、 大肠 埃希 菌 、 无乳链 球 菌 、 金 黄 色葡萄球 菌 、 嗜肺 巴 氏杆 菌 、 铜绿 假 单 胞 菌及 枯 草 杆 菌
中图分类号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ １； Ｑ７ ８ ６ 文献标识码 ： Ａ 文 章编 号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ３ ） １ １ － ０ ０ ４ ０ — ０ ６
牛分 支杆 菌 （ Ｍｙ ｃ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｂ ｏ ｒ ｉ ｓ ） 是 一 种 革 兰 阳性 菌 ， 在外 界环境 中生存 能力 强 ， 是牛 结 核病 的主 要病 原 菌之一 。牛结核 病严 重影 响 畜牧 养 殖业 的发 展， 世界 动物 卫 生组 织 （ ＯＩ Ｅ） 将 该 病 列 为 必 须 通 报 的疫 病 ， 在我 国属 二类 动物 传染 病 ， 患病 牛 被 列 为法 定 的检 疫 扑 杀 对 象１ ］ ］ 。牛 分 支 杆 菌 感 染 牛 后 会 随 血 液循 环进 入 乳 汁 ， 对 消 费 者 的健 康 构 成 威 胁 。有 研究证明， 截至 目前 ， 在 尼 日利 亚 、 突尼 斯 等许 多非 洲 国家依 然存 在 销 售 、 直 接 食 用 未 经 巴 氏 消 毒 的 生 鲜牛 奶及 其相 关乳 制 品的 现象 ｊ ， 人 若 饮用 消 毒 不 彻底 的 牛奶经 消 化 道 就 可 能 感 染 牛 分 支杆 菌 ， 引 发 结 核病 。所 以 ， 未经 彻 底 消 毒 的感 染 牛 分 支 杆 菌 的 生 鲜牛 奶仍 然是 传播 结核 病 的高危 因素 。
生 方面 都有 重要 的意 义 。
草杆菌（ Ｂ ． ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ） 等， 均 由西 北农 林 科 技大 学 动 物
医学 院预 防兽 医学 实验 室保存 。 １ ． １ ． ２ 主要试 剂 细 菌 基 因 组 ＤＮＡ 提 取 试 剂 盒 、
牛 分 支杆菌 检 测 的传 统 方 法 如 细 菌 学 检 验 、 免
生 鲜 牛 奶 中牛 分 支 杆 菌 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法 的 建 立
程 亮 ， 宁 蓬 勃 ， 张彦 明 ， 曹伟 伟 ’ ， 刘 伟 ， 战 仁 武
（ １ ． 西 北 农 林 科 技 大学 动 物 医 学 院 ， 陕西杨凌 ７ １ ２ １ ０ ０ ； ２ ． 新乡市动物卫生监督所 ， 河南新乡 ４ ５ ３ ０ ０ ０ ）
疫 学检 验等 方法 费 时费 力 ， 已经 不能 完 全 适 应 当今 快速 、 准确 检疫 的要 求 。随 着分 子 生 物学 技 术 的 发 展， Ｐ Ｃ Ｒ技术 被越来 越 多地 应用 到 了结 核 分 支 杆 菌 检测 以及 分类 中口 。 。由于 牛 分支 杆 菌 与 结 核 分 支
ｐ ｎ ｅ ｕ ｍｏ ｔ ｒ ｏ ｐ ｉ ｃ ａ ） 、 铜绿 假 单 胞 菌 （ Ｐ． ａ ｅ ｒ ｕ ｇ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ ） 、 枯
断技术 》 （ ＧＢ ／ Ｔ １ ８ ６ ４ ５ —２ ０ ０ ２ ） 规定 ， 乳 液 可 以作 为 检测样 本对 牛结 核病 诊 断 。与其他 诊 断 检测 样 本 如 血液 、 病灶 组织 、 黏 液拭 子 等 比较 ， 牛 奶 样 品 的 采 集 对动 物没 有伤 害且 更容 易得 到 。严 格检 测并 监 控 生 鲜 牛奶 中 的牛分支 杆 菌在 牛结核 病 的检 疫 及公 共 卫
的乳样 中均 未扩 增 出任何 条 带。牛 分 支杆 菌的 ＤＮＡ 最低检 测 限 为 １ ２ ． １ ８ Ｐ ｇ ／ Ｉ ｚ Ｌ， 牛分 支杆 菌 污染 牛奶模 型 的敏 感性 为 ３ ｃ ｆ ｕ ／ ｍＩ 。建 立的 方法 可 用于牛奶 中牛 分 支杆 菌的检 测 。 关键词 ： 牛分 支杆 菌 ； 聚合 酶链 反应 ； 生鲜 牛奶
按 照 中华人 民共 和 国 国 家 标 准《 动 物 结 核 病 Байду номын сангаас
啶（ Ｃ ） 与胸 腺 嘧啶 （ Ｇ） 发 生变 化 ， 从 而利 用 该 段 序列 中 的基 因点 突变这 个 特点 ， 应用 Ｐ Ｃ Ｒ方 法 便能 够将 牛分支 杆菌 与结 核分 支杆 菌鉴 别 开来 。本研 究 参 照 牛分 支杆 菌 的特异 性序 列 ｐ ｎ ｃ Ａ， 设 计 引物进 行 Ｐ Ｃ Ｒ