基因工程-第6章-基因文库的构建与目的基因的获得.
基因工程的操作步骤
利用PCR技术扩增目的基因
原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列, 以便合成引物。
过程
预变性 增加DNA变性的概率
高温变性 解旋为单链
低温退火 引物与单链互补结合 适温延伸 在Taq酶的作用下合成
与模板互补的DNA双链 重复循环
归纳: 基因工程的基本操作程序. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,它能阻碍RNA聚合酶的移动, 并使其从DNA模板链上脱离下来,使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质. 以模板转录 然后脱落
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
原核 细胞 的基 因结
构
编码区 能转录相应的信使RNA,能编码蛋白质
知识点二.基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细 胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、获取目的基因
目的基因主要是__编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因__
1.获取目的基因的途径
A.从自然界已有的物种中分离
B.人工合成
2.获取目的基因的方法
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因 DNA分子杂交技术 是否转录 mRNA分子杂交技术 是否翻译 抗原—抗体杂交技术
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
目的基因的克隆与基因文库的构建
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编e Chain Reaction）法，又称为聚合酶
链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
C PCR法
5‘
5‘
目的基因
5‘
变性
加热
5‘
5‘
引物
退火
5‘
5‘
底物
聚合
5‘
5‘
5‘
5‘
加热
变性
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
1
混合退火
2
T4-DNA连接酶连接
3
克隆入合适的载体
4
Klenow酶聚合
5
大片段酶促法： 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
6
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
基因文库的构建与使用
基因工程中，需要将某种生物的遗传信息贮存在 可以长期保存的稳定的重组体中，通常是将目的基因 用适当的工具酶连接到低等微生物如细菌的质粒、噬 菌体等载体上，克复杂的染色体ＤＮＡ 分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的 基因组中将其活跃的化学能储存在ＡＴＰ
中；暗反应是利用光反应产生的ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ把Ｃ０２ 合成糖类等有机物，同时把ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ中活跃的化 学能转变成稳定的化学能贮存在有机物中。 ２．２细胞呼吸生物体的生命活动都需要消耗能量， 这些能量来自生物体内的糖类、脂质和蛋白质等有机 物的氧化分解。细胞呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两 种类型。有氧呼吸主要在细胞的线粒体中进行，１ｍｏｌ 葡萄糖彻底氧化分解共释放２８７０ｋｊ的能量，其中有 １１６１ｌ【Ｊ左右的能量储存在ＡＴＰ中，其余的能量都以热 能的形式散失了；无氧呼吸释放的能量比有氧呼吸要 少得多，例如，１ｍｏｌ葡萄糖在分饵成乳酸以后，共释放 出１９６．６５ＩｃＪ的能量，其中有６１．０８ｌ【Ｊ的能量储存在 ＡＴＰ中，其余的能量以热能的形式散失了。
・・・・・・・・・・・・・＋？＋・・・・・・・・・・・・・・・・ｔ・・・・・・・・．Ｈ・◆・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・◆－・・・・・。＋＋・位点及选择标记，还具有控制基因表达的序列（如启动子、ＳＤ序 列、Ａ’ｒＧ、终止子等），可在宿主细胞中表达出克隆片段 的编码产物。表达载体又有融合蛋白表是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可 蛋白质具有 抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。◆
直接能源
生物体内的直接能源是ＡＴＰ，ＡＴＰ水
解时释放的能量直接用于各项生命活动。而其他形式 的能源物质中所贮存的能量都必须转移到ＡＴＰ中才 能用于各项生命活动。ＡＴＰ与ＡＤＰ之间的转化实现 能量的释放和储存，植物生成ＡＴＰ的途径有光合作用 和呼吸作用，而动物生成ＡＴＰ的途径只有呼吸作用。 １．２主要能源糖类、脂肪和蛋白质等有机物中都含 有大量的能量，这些有机物氧化分解后释放的能量转 移到ＡＴＰ中，用于各项生命活动。但是，生命活动所 利用的能量约７０％是由糖类提供的。所以，糖类是生 命活动的主要能源物质。 １。３储备能源 在生物体内长期贮存能量的物质是 脂肪。脂肪贮存能源的效率最高，１ ｇ脂肪所贮存的能 量是蛋白质和糖类的２倍多，所以在进化过程中，生物 体选择脂肪作为长期贮存能量的物质。 １．４辅助能源 在生物体内的高能磷酸化合物中除 了ＡＴＰ外，还有磷酸肌酸。但是磷酸肌酸中贮存的能 量并不能直接用于各项生命活动，必须转移到ＡＴＰ中 后才能被生命活动利用。生物体全部基使之成为一定大小的片物组织中分离出纯化的基因组ＤＮＡ，用限 制酶进行部分降解或完全降解，得到各种长度的ＤＮＡ 片段；②ＤＮＡ片段与载体连接。常用噬菌体ＤＮＡ作载 体，它既有较高的克隆效率，又可容纳较大的外源 ＤＮＡ片段。用限制性内切酶切割载体ＤＮＡ，使载体形 成与外源ＤＮＡ相匹配的黏性末端。再用ＤＮＡ连接酶 将ＤＮＡ片段与载体连接起来，成为重组ＤＮＡ；③重组 ＤＮＡ的转化和克隆。将重组ＤＮＡ导入受体菌中，进行 体外包装噬菌体进行侵染，或者转化时质粒ＤＮＡ组ＤＮＡ克隆，因此 利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所 需要的目的基因片段的重组克隆体。
目的基因的获取
目的基因的获取基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。
为此必须从现有生物群中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。
这类基因称之为目的基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
目前目的基因的获取方法主要有以下2类：（1）已知基因的获得：PCR分离法和化学合成法等（2）未知基因的获得：直接分离法和基因文库分离法等第一节直接分离法1、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
应用对象：适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少，获得也比较简单。
（1）对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。
（2）对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。
（3）即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。
2. 随机片断化2.1. 限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
2.2 机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。
（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
3. 物理化学法基本原理：DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、A T间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。
3.1密度梯度离心法由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大，利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分离开来。
然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
基因工程基本操作的四个步骤
反转录酶
杂交双链
(单链RNA/单链DNA)
核酸酶H
单链DNA DNA聚合 酶
因的获得 ③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测 出相应的信使RNA序 列，然后按照碱基互 补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷 酸序列，再通过化学 方法，以单核苷酸为 原料合成目的基因。(一)从基因中获取目的基因1.基因
将含有某种生物不同基因的许多
DNA片断，导入到受体菌的群体中，各
个受体菌分别(直接分离法)
__D_N_A_聚__合__酶__.前提条件：
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
蛋白质的氨基酸序列 推测
mRNA的核苷酸序列
推测 结构基因的核苷酸序列
化学合成 目的基因
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点
缺点
鸟枪法
操作简便 广泛使用
工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因
反转录法
操作过程麻烦， 专一性强 mRNA很不稳定，要
求的技术条件较高
根据已知氨基 酸合成DNA法
四种脱氧核苷酸dNTP 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物 温度控制
④方式：以_指__数__方式扩增，即_2_n __（n为扩增循 环的次数）
⑤结果：
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
基因工程操作的基本路线
基因工程操作的基本路线通常包括以下几个主要步骤：
目的基因的获取：基因工程的第一步是获取目的基因，即需要操作的基因片段。
目的基因可以从基因文库中筛选获取，也可以通过PCR技术等从生物样本中直接克隆得到。
载体的选择与构建：载体是承载目的基因的工具，常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
根据目的基因的性质和需要的表达水平，选择合适的载体并进行必要的改造与构建。
重组DNA的构建：将目的基因与载体在体外进行重组，构成重组DNA，这一步通常依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用。
重组DNA的转化：将重组DNA转入宿主细胞，常用的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化的方法包括化学转化法、电穿孔法等。
重组细胞的筛选与鉴定：在转化后的细胞群体中，筛选出含有目的基因的细胞，并进行基因表达的检测与鉴定，确定目的基因是否正确表达。
基因表达产物的分离与纯化：对于表达的目的蛋白，需要进行分离与纯化，以获得高纯度的产物。
功能与效价分析：对纯化的目的蛋白进行功能与效价分析，以评估其是否符合预期的要求。
安全性评估与法规符合性检查：对整个操作过程进行安全性评估，确保无潜在的安全风险。
同时，需要检查是否符合相关的法规与标准。
生产与质量控制：如果目的基因表达的产物用于生产或质量控制，则需要制定相应的生产流程和质量标准。
总的来说，基因工程操作的基本路线是一个复杂而精细的过程，每个步骤都需要严格的操作规范和质量控制。
如何通过构建基因文库来获取目的基因
如何通过构建基因⽂库来获取⽬的基因⼀、概念主要有两种基因⽂库：基因组⽂库和cDNA⽂库。
基因组⽂库：⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切后，将酶切⽚段插⼊到载体DNA分⼦中，所有这些插⼊了基因组DNA⽚段的载体分⼦的集合体，将包含这个⽣物体的整个基因组，也就是构成了这个⽣物体的基因⽂库。
cDNA⽂库：是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的cDNA⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合体。
⼆、构建基因⽂库的主要程序1、DNA提取及⽚段化或是cDNA的合成⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切或全部mRNA经反转录形成的cDNA⽚段。
2、载体的选择及制备这些载体可以分为两类，⼀类是基于噬菌体改建的，利⽤了噬菌体的包装效率⾼和杂交筛选背景低的优点；另⼀类经改造的质粒载体或⼈⼯染⾊体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源⽚段。
3、DNA⽚段或cDNA与载体连接⽤重组DNA技术将某种⽣物细胞的DNA的所有⽚断随机地连接到基因载体上。
4、重组体转化宿主细胞⽤质粒作为载体的重组DNA分⼦可以通过转化引进细胞。
⽤λ噬菌体的DNA作载体的重组分⼦直接经转染引⼊细胞的效率较低；⼀般需先⾏离体包装，即把重组DNA分⼦包在噬菌体外壳中，再通过噬菌体感染⽽把重组DNA分⼦引⼊敏感细菌细胞中。
三、鉴定和转化细胞的筛选当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。
然⽽，它只是分离基因的第⼀步，基因克隆后还要对克隆的基因进⾏分离。
因此，还必须对其进⾏必要的检测与分析，如序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。
通过这些实验确定基因结构及功能，此时才能算分离到了⽬的基因。
所以，基因克隆、克隆基因分离、分离基因鉴定是利⽤基因⽂库技术分离⽬的基因的主要内容。
从基因⽂库中筛选某⼀克隆的基因常⽤办法是分⼦杂交。
⾸先把属于⼀个⽂库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养⽫上以取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后⽤硝酸纤维滤膜吸印，使培养⽫和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。
基因工程的基本操作程序的步骤
相同点
原则
碱基互补配对
原料 4种游离的脱氧核苷酸
模板
DNA双链
不同点 解旋方式
加热
解旋酶Biblioteka 场所体外细胞核
酶 结果
Taq酶 细胞内的 DNA聚合酶
大量的DNA 形成整个的
片段
DNA分子
（三）用化学方法直接人工合成 条件：基因较小，核苷酸序列已知。 仪器：DNA合成仪
二、基因表达载体的构建
1、元件：
复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子
与细胞膜无关 用Ca2+处理细胞→ 感受态细胞
重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
1、导入目的基因后需要检测哪些方面？ 各采取什么方法？
2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探 针通过什么原理来检测目的基因和相 应的mRNA？
3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什 么？
基
片段 拼接到载体上
因
组
导入受体细胞DN？
依据目的基因的有关信息。
如：根据 基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质等特性。
b.使目的基因能够表达和发挥作用。
载体与基因表达载体的区别：
载体的组成：
复制原点+目的基因插入位点+标记基因 基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子
同：二者均有标记基因和复制原点 异：表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、
终止子三部分结构 （其中启动子、终止子对于目的基因的表达（转录步骤）
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中获得目的基因的方法有以下几种：
1. PCR扩增法：利用聚合酶链反应（PCR）从一个已知源
DNA扩增目的基因的特定片段。
这种方法需要已知目的基因
的序列或者已知相关基因的序列来设计引物，通过PCR扩增
特定片段。
2. 基因合成法：利用化学合成技术合成目的基因的DNA序列。
这种方法可以通过合成多个片段，再进行连接而合成完整的目的基因。
3. DNA文库筛选法：构建基因文库，将源DNA片段插入载体中形成DNA文库。
然后利用对目的基因编码的蛋白质进行筛选，找出含有目的基因的载体。
4. 基因克隆法：将目的基因从一个生物体中剪切出来，然后将其插入到另一个载体中，形成重组DNA。
这种方法通常使用
限制酶切和连接酶进行DNA分割和连接。
5. 基因编辑法：利用CRISPR-Cas9、TALENs或ZFNs等基因
编辑技术，直接对细胞或生物体进行基因编辑，将目的基因插入到细胞或生物体的基因组中。
这些方法可以根据具体的实验需求和技术可行性来选择合适的方法来获得目的基因。
DNA文库的构建和目的基因ppt课件
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
16
基因工程的四个步骤高中生物
基因工程的四个步骤可以简述为以下四步：
1. 目的基因的获取：从基因文库中获取或利用PCR技术扩增基因组DNA。
2. 基因表达载体的构建：基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
3. 受体细胞的选择和培养：根据基因工程的需要，选择适当的受体细胞并进行培养。
4. 基因的转化：将目的基因导入受体细胞。
这四个步骤在高中生物中的具体应用和解释如下：
1. 目的基因的获取：目的基因是从基因库或实验室设计合成，而PCR技术扩增基因组DNA 使得获取目的基因更加便捷。
例如，对于某个特定的生物性状，可以通过分析已知的基因序列来合成目的基因。
2. 基因表达载体的构建：这是将目的基因与合适的启动子、终止子和标记基因等调控组件重组在一起的过程。
这确保了目的基因能在细胞内以特定的方式表达，从而产生所需要的蛋白质。
3. 受体细胞的选择和培养：受体细胞可以是植物细胞、动物细胞或微生物细胞。
高中生物中可能涉及到植物组织培养的内容，就是利用基因工程技术培养符合要求的新植物个体。
4. 基因的转化：这一步是通过某种转化技术，如电转化、显微注射等方法，将重组的表达载体导入受体细胞。
这一步的关键在于确保表达载体准确无误地进入细胞，并且能够在细胞内正常运作。
以上就是基因工程的四个步骤在高中生物中的具体应用和解释。
总的来说，这些步骤体现了现代生物技术的核心内容，即通过改变遗传物质来创造新的生物或修改现有生物的特性。
这些技术不仅在科学研究中具有重要价值，也在工农业生产、医药卫生等领域有着广泛的应用前景。
第六章 目的基因获取和DNA重组
DNA片段的组装连接方法有2种：
第一种方法：粘末端连接法
第 二 种 方 法二、 基因法获取目的基因即直接从基因中生物基因组所程
第一节 目的基因的获得
获得目的基因的方法：主要有4种 1
一、基因合成技术
基因合成，指利用4种单体脱氧核糖核苷酸 (Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ），通过化学反应，合成出一 条与已知基因序列完全相同的DNA链。
对不参加反应的集团加保护基
◆合成过程使用的保护基团，有些可以通过酸处理 移去，有的可通过碱处理移去。所以不论是5′端 的保护基团、还是3′端的保护基团，都可以通过 酸或碱的脱保护，消除掉保护集团。这样的一个 带有5′端保护的合成的二核苷酸分子，又可以同 下一个带3′端保护的单核苷酸或二核苷酸进行第 二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分 子，这种从缩合反应开始，到保护基团消除，进 而再进行新的缩合反应的循环周期库是一项十分繁重的工作，一般的 基因工程实验室都难以完成此亿碱基对，即3×106kb. (2)常用的克隆载体质粒、λ噬菌体和COS质粒克隆外 源DNA的能力分别为15kb、25kb和45kb. （3）选取克隆能力最大的COS质粒载体，则需要构建 至少6.8万个克隆才可能包含整个人的基因组DNA
（2）mRNA的纯化和完整性鉴定
在典型的哺乳动物细胞中含有10000～30000种不同的 mRNA序列，但并不是任一基因的mRNA在每一细胞中都有同样 的转录数量，在特定的mRNA分子集群中，有些基因的mRNA数 量很高，而另一些基因的mRNA数量却很低，例如编码像珠蛋 白、免疫球蛋白质和卵清蛋白的mRNA，占特定类型的分化细 胞总mRNA的50%～90%，属高丰度mRNA，而相当数量的其它基 因mRNA的含量在细胞总mRNA中少于0.5%，属低丰度mRNA或稀 有mRNA。 对高丰度mRNA来讲，其所对应的A之前不需要进一步纯化和富集。但对低丰度mRNA的分离 则需要采用特殊是脱氧核糖核苷三磷酸为合成原材料。
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性的确定；（2） cDNA 的合成和克 隆；（3）目的cDNA的鉴定等步骤。 (1) 总RNA的提取 (2) mRNA的分离 (3) mRNA的纯化 (4) cDNA第一条链的合成:①随机引物法； ②oligo-dT(12-18)引物法 (5) cDNA第二条链的合成 (6) cDNA的甲基化和接头的加入 (7) cDNA同载体的连接 (8) 噬菌体蛋白的体外包装 （9）噬菌斑原位杂交分离基因
2 用TRIZOL试剂盒提取总RNA 1) 匀浆 在 1ml 的 TRIZOL 试剂中加 50-100mg 组织，样 本体积不应超过 TRIZOL 的 10% 。用匀浆机高 速匀浆2分钟。 2)（可选） 要分离蛋白、脂肪、多糖或细胞外物质如肌肉、 脂肪组织，在匀浆后2-8℃ 12000g离心10分钟。 将上清匀转移至一新的Eppendof管。 3) 分相 15-30℃温育5分钟，完全解离核蛋白复合体。 加0.2ml氯仿，用力摇动15秒，15-30℃放置23分钟。小于12000g 2-8℃离心15分钟。
6.2 c 基因的分离 cDNA的克隆对于特定基因的分离类型中已经被转 录成m同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特 定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各 自的 mRNA次后，上清加 1/10体积3M 乙酸钠和3倍体积无水乙醇，在－ 20℃沉淀过夜。 6）12000rpm离心15min，沉淀溶于0.5ml STE中，加蛋白酶K至200μg/ml，56℃消化1h。 等体积热苯酚：氯仿抽提，冷却离心，重复一 次。 7）上清加2.5倍体积无水乙醇沉淀过液。离心， 70%乙醇洗沉淀，干燥后，溶于
基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、 扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展 核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。 通常将那些已被或者准备要被分离、改造、 扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目 的基因。 要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小 的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第 一个难题。欲想获得某个目的基因，必须对 其有所了解，然后根据目的基因的性质制定 分离的方案。
基因组DNA有着非常广泛的用途。如用 以分析、分离特定的基因片段；通过染色体 步行（chromasome walking）研究基因的组 织结构；用于基因表达调空研究；用于人类 染色体大分子DNA的提取和大片段 的制备；（2）载体DNA的制备；（3）载体 与外源大片
目前主要应用化学合成法、目的基因的直接 分离法和逆转录法来分离、获得目的基因。 PCR技术的问世及其在基因工程中广泛 （transposon tagging）、mRNA 差异显示 法（mRNA differential disply）、RFLP 及 ESTs等技术也已经在分子克隆工作中展现出 广阔的前景。
1975年=ln(1-P)/ln(1-f) N为所需要的重组体的数目， P为选出 某一基因的期望概率（通常期望为 99%）， f为单个重组体中的平均插入 片段与基因组DNA总量之比。
例如要在一哺乳动物基率，则需 N=ln(1-0.99)/ln[1-(1.7×104bp / 3×10才能代表整个的基因组。
总RNA的提取 凡与RNA操作有关的玻璃器皿经常规洗净后， 用 0.1% 的焦碳酸二乙酯（ DEPC ）浸泡处理 （ 37℃， 2 小时），再用灭菌双蒸水漂洗几次。 高压消毒去除 DEPC，然后250℃烘烤4小时以 上或 180℃ 8 小时以上。塑料器材最好使用灭 菌的一次性使用的塑料用品， Eppendorf 管、 微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压灭 菌。所有溶液应加DEPC至终浓度0.05%-0.1%， 室温 处 理过 夜 ，然 后 高压 处 理 。 DEPC 易与 Tris 反 应 ， 配 制 Tris 溶 液 的 水 应 先 用 0.1%DEPC处理，高压消毒，配好后再高压消 毒。
1 异硫氰酸胍----热苯酚法 1）将实验用的全部用品用0.1%的DEPC水浸 泡过夜，然后高压灭菌，玻璃器皿在180 ℃烘烤8h以上，塑料制品80℃烘干。 2）将0.1g组织样品在研钵中迅速研成粉末， 放入装有1ml GITC试剂的匀浆管中匀浆。 匀浆液取出放在1.5ml离心管中，吸打几次以 剪切染色质DNA，60℃温浴10min。 3）加入等体积60℃苯酚，混匀，抽提。 4）冰中冷却，10000rpm离心10min。取上清， 用热苯酚重复A library） 是指 将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶切后 （必要时对这些DNA片段进行密度梯度离心 或经制备型凝胶电泳进行分级分离，以选择 长度适合于插入载体的片段）所产生的基因 组片段随机地同相应的载体重组、克隆，所 产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序 列。